{"id":3130,"date":"2023-01-09T11:29:08","date_gmt":"2023-01-09T17:29:08","guid":{"rendered":"https:\/\/nuevo22.cidsamexico.com\/?post_type=al_product&p=3130"},"modified":"2023-01-20T16:45:27","modified_gmt":"2023-01-20T22:45:27","slug":"amplite-universal-fluorimetric-kinase-assay-kit-red-fluorescence","status":"publish","type":"al_product","link":"https:\/\/nuevo22.cidsamexico.com\/index.php\/productos\/amplite-universal-fluorimetric-kinase-assay-kit-red-fluorescence\/","title":{"rendered":"Amplite\u00ae Universal Fluorimetric Kinase Assay Kit *Red Fluorescence*"},"content":{"rendered":"\n

La mayor\u00eda de los kits comerciales de ensayo de prote\u00edna quinasa se basan en el control de la formaci\u00f3n de fosfop\u00e9ptidos o en la eliminaci\u00f3n de ATP. Para los kits de ensayo de quinasa que se basan en la detecci\u00f3n de fosfop\u00e9ptidos, se debe dedicar tiempo y esfuerzo para identificar un sustrato pept\u00eddico optimizado, mientras que el m\u00e9todo de depleci\u00f3n de ATP sufre varias interferencias debido al uso de luciferasa que son inhibidas o activadas por varios compuestos biol\u00f3gicos. El kit de ensayo de cinasa universal Amplite\u00ae se basa en el control de la formaci\u00f3n de ADP, que es directamente proporcional a la actividad de la enzima fosfotransferasa y se mide fluorom\u00e9tricamente. <\/p>\n\n\n\n

Este kit proporciona un ensayo r\u00e1pido, simple y homog\u00e9neo para medir la actividad de las quinasas. Las caracter\u00edsticas de su alta sensibilidad (<0,2 uM ADP), amplia tolerancia ATP (1-300 uM), m\u00e9todo no basado en anticuerpos, no radiactivo y sin lavado para detectar la cantidad de ADP producido como resultado de la actividad enzim\u00e1tica hacen un kit ideal para determinar la cin\u00e9tica de la cinasa Michaelis-Menten y para detectar e identificar inhibidores de la cinasa. El ensayo se puede realizar en un conveniente formato de placa de microtitulaci\u00f3n de 96 pozos o de 384 pozos y se puede adaptar f\u00e1cilmente a la automatizaci\u00f3n sin necesidad de pasos de separaci\u00f3n.<\/p>\n\n\n\n

<\/div>\n\n\n\n
Catalogo<\/th>Producto<\/th>Presentaci\u00f3n<\/th><\/tr><\/thead>
AAT-31001<\/td>Amplite\u00ae Universal Fluorimetric Kinase Assay Kit *Red Fluorescence*<\/td>250 pruebas<\/td><\/tr>
AAT-31002<\/td>Amplite\u00ae Universal Fluorimetric Kinase Assay Kit *Red Fluorescence*<\/td>500 pruebas<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n\n\n
<\/div>\n\n\n\n
\n
\"pdf\"\/<\/figure>\n\n\n\n

SDS<\/a><\/p>\n\n\n\n

\"pdf\"\/<\/figure>\n\n\n\n

Protocol<\/a><\/p>\n<\/div>\n\n\n\n

Importante: Solo para uso en investigaci\u00f3n (RUO). <\/p>\n\n\n\n

<\/div>\n\n\n\n

Plataforma<\/mark><\/p>\n\n\n\n

Lector de microplacas de Fluorescencia <\/mark><\/p>\n\n\n\n

Excitaci\u00f3n<\/td>540 nm<\/td><\/tr>
Emisi\u00f3n<\/td>590 nm<\/td><\/tr>
Cutoff<\/td>570 nm<\/td><\/tr>
Placa recomendada<\/td>Negra s\u00f3lida<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n\n\n
<\/div>\n\n\n\n

Componentes<\/mark><\/p>\n\n\n\n

Componente A: ADP Sensor Buffer<\/td>1 vial (5 mL)<\/td><\/tr>
Componente B1: ADP Sensor I (Sensible a la luz)<\/td>1 vial (en polvo)<\/td><\/tr>
Componente B2: ADP Sensor II<\/td>1 vial (2.5 mL)<\/td><\/tr>
Componente B3: DMSO<\/td>1 vial (100 \u00b5L)<\/td><\/tr>
Componente C: ADP Standard<\/td>1 vial <\/td><\/tr>
Componente D: ADP Assay Buffer<\/td>1 vial (10 mL)<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n\n\n
<\/div>\n\n\n\n

PREPARACION DE SOLUCION DE STOCK<\/p>\n\n\n\n

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A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en al\u00edcuotas de un solo uso y almacenarse a -20 \u00b0C despu\u00e9s de la preparaci\u00f3n. Evite los ciclos repetidos de congelaci\u00f3n y descongelaci\u00f3n.<\/em><\/p>\n\n\n\n

  1. Soluci\u00f3n madre del sensor I de ADP (50X):<\/em>
    Agregue 50 \u00b5L de DMSO (Componente B3) en el vial del Sensor 1 de ADP (Componente B1) para preparar una soluci\u00f3n madre del Sensor I de ADP 50X.<\/li>
  2. Soluci\u00f3n est\u00e1ndar de ADP (300 mM):<\/em>
    Agregue 100 \u00b5l de ddH2O al est\u00e1ndar de ADP (componente C) para hacer una soluci\u00f3n est\u00e1ndar de ADP de 300 mM.<\/li><\/ol>\n<\/div><\/div>\n\n\n\n
    \n\n\n\n

    PREPARACION DE SOLUCION ESTANDAR<\/p>\n\n\n\n

    \n

    Est\u00e1ndar ADP<\/strong><\/p>\n\n\n\n

    Para mayor comodidad, utilice el Planificador de diluci\u00f3n en serie: https:\/\/www.aatbio.com\/tools\/serial-dilution\/31001<\/a> <\/p>\n\n\n\n

    Tome una soluci\u00f3n est\u00e1ndar de ADP de 300 mM y diluya 10.000X en buffer de reacci\u00f3n de quinasa para hacer una soluci\u00f3n est\u00e1ndar de ADP de 30 \u00b5M. Tome una soluci\u00f3n est\u00e1ndar de ADP de 30 \u00b5M y realice una diluci\u00f3n en serie 1:3 en buffer de reacci\u00f3n de quinasa para diluir en serie la soluci\u00f3n est\u00e1ndar de ADP. Nota: Realice diluciones en serie del est\u00e1ndar de ADP en el buffer de reacci\u00f3n de quinasa incluyendo una muestra sin ADP para medir la fluorescencia de fondo.<\/p>\n<\/div><\/div>\n\n\n\n

    \n\n\n\n

    PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO<\/p>\n\n\n\n

    \n

    Agregue 50 \u00b5l de soluci\u00f3n madre del sensor I de ADP 50X en el vial del sensor II de ADP (componente B2) para que la soluci\u00f3n del sensor de ADP funcione. Nota: El sensor ADP reconstituido no es estable, renueve seg\u00fan sea necesario.<\/p>\n<\/div><\/div>\n\n\n\n

    <\/div>\n\n\n\n

    Imagenes<\/mark><\/p>\n\n\n\n

    \"\"
    Fig. 1<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n

    Figura 1.<\/strong> La respuesta a la dosis de ADP se midi\u00f3 con el kit de ensayo de quinasa fluorim\u00e9trica universal Amplite\u00ae en una placa negra s\u00f3lida de 384 pozos utilizando un lector de microplacas de fluorescencia Gemini (Molecular Devices).<\/p>\n\n\n\n

    <\/div>\n\n\n\n
    \"\"
    Fig. 2<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n

    Figura 2.<\/strong> Detecci\u00f3n de prote\u00edna quinasa A con el kit de ensayo de quinasa fluorim\u00e9trica Amplite\u00ae. La quinasa se incub\u00f3 en presencia de ATP y sustrato pept\u00eddico de kemptide durante 30 minutos, y la generaci\u00f3n de ADP se detect\u00f3 despu\u00e9s de 30 minutos de incubaci\u00f3n utilizando el kit de ensayo de quinasa fluorim\u00e9trica Amplite\u00ae.<\/p>\n\n\n\n

    <\/div>\n\n\n\n
    \"\"
    Fig. 3<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n

    Figura 3<\/strong>. La fosforilaci\u00f3n mediada por PLK1 suprimi\u00f3 la actividad de NDR1 para garantizar la orientaci\u00f3n adecuada del huso. (a) Inmunotransferencia de lisados de c\u00e9lulas HeLa mit\u00f3ticas que expresan GFP-NDR1WT, GFP-NDR13A o GFP-NDR13E, con anticuerpos anti-GFP y anti-pT444-NDR1. La cuantificaci\u00f3n se muestra a la derecha. Las barras representan medias\u2009\u00b1\u2009SD, n\u2009=\u20093. (b) Medida de la actividad de la cinasa de Flag-NDR1 de tipo salvaje o mutantes (3A, 3E, K118A y EAIS) purificada a partir del ensayo de cinasa in vitro de c\u00e9lulas 293\u2009T as\u00edncronas. Las transferencias\/geles completos se presentan en la figura complementaria S4. (c) y (d) Determinaci\u00f3n de los par\u00e1metros cin\u00e9ticos de NDR1WT, NDR1K118A y NDR13E. Las velocidades del ensayo de cinasa hacia el p\u00e9ptido sustrato de 10 mer (c) o ATP (d) a concentraciones variables se midieron con el kit de ensayo de cinasa fluorim\u00e9trica universal AmpliteTM. Los datos de tres experimentos independientes se analizaron en GraphPad Prism y se ajustaron con la ecuaci\u00f3n de Michaelis-Menten para extraer los par\u00e1metros cin\u00e9ticos. Las barras indican la media \u00b1 DE. (e) An\u00e1lisis de inmunotransferencia de lisados de c\u00e9lulas HeLa sincronizados con tratamiento (+BI2536) o sin (+DMSO) BI2536, con los anticuerpos contra las prote\u00ednas indicadas. \u201cM\u201d representa mitosis. La cuantificaci\u00f3n se muestra a la derecha. Las barras representan medias \u00b1 SD de 3 experimentos independientes. Las transferencias\/geles de longitud completa se presentan en la Figura complementaria S4. (f) Medida de la actividad de la cinasa de LAP-NDR1 purificada a partir de c\u00e9lulas HeLa de expresi\u00f3n estable LAP-NDR1 sincronizadas con tratamiento (+BI2536) o sin (+DMSO) BI2536, o HeLa normal c\u00e9lulas (N.C.) ensayo de quinasa in vitro. Las transferencias \/ geles de longitud completa se presentan en la Figura complementaria S4. ( g ) Descripci\u00f3n general esquem\u00e1tica del procedimiento experimental de ( h ). ( h ) Cuantificaci\u00f3n de los \u00e1ngulos del huso de las c\u00e9lulas HeLa mit\u00f3ticas que expresan siRNA NDR1 (+siNDR1) o no, con o sin tratamiento con BI2536, como se describe en ( g ). Las im\u00e1genes de inmunofluorescencia se obtuvieron y analizaron como en la Fig. 1e. “CAROLINA DEL NORTE.” representa c\u00e9lulas sin transfecci\u00f3n ni tratamiento con BI2536. Las barras indican medias \u00b1 SEM de an\u00e1lisis de no menos de 40 c\u00e9lulas con husos deformados. Prueba t de Student de dos colas para el c\u00e1lculo del valor p. (i) Resumen esquem\u00e1tico del procedimiento experimental de (j). (j) Gr\u00e1ficos de dispersi\u00f3n de los \u00e1ngulos del huso en c\u00e9lulas HeLa mit\u00f3ticas transfectadas con ARNip de NDR1 m\u00e1s varias construcciones de NDR1 resistentes a ARNip , como se describe en (i). Las im\u00e1genes de inmunofluorescencia se obtuvieron y analizaron como en la Figura 1e. Las barras indican medias \u00b1 SEM de an\u00e1lisis de 40 c\u00e9lulas. Prueba t de Student de dos colas para el c\u00e1lculo del valor p. Fuente: la regulaci\u00f3n de la actividad de NDR1 por PLK1 garantiza la orientaci\u00f3n adecuada del huso en la mitosis por Yan et al., Scientific Reports, junio de 2015.<\/p>\n\n\n\n

    <\/div>\n\n\n\n

    Bibliograf\u00eda<\/mark><\/mark><\/mark><\/p>\n\n\n\n

    Resveratrol-induced Sirt1 phosphorylation by LKB1 mediates mitochondrial metabolism<\/a>
    Authors: <\/strong>Huang, Yuanyuan and Lu, Jianlin and Zhan, Li and Wang, Ming and Shi, Ronghua and Yuan, Xiao and Gao, Xinjiao and Liu, Xing and Zang, Jianye and Liu, Wei and others,
    Journal: <\/strong>Journal of Biological Chemistry (2021)<\/p>\n\n\n\n

    Feedback control of PLK1 by Apolo1 ensures accurate chromosome segregation<\/a>
    Authors: <\/strong>Xu, Leilei and Ali, Mahboob and Duan, Wenxiu and Yuan, Xiao and Garba, Fatima and Mullen, McKay and Sun, Binwen and Poser, Ina and Duan, Hequan and Lu, Jianlin and others,
    Journal: <\/strong>Cell Reports (2021): 109343<\/p>\n\n\n\n

    Methylation of PLK1 by SET7\/9 ensures accurate kinetochore–microtubule dynamics<\/a>
    Authors: <\/strong>Yu, Ruoying and Wu, Huihui and Ismail, Hazrat and Du, Shihao and Cao, Jun and Wang, Jianyu and Ward, Tarsha and Yang, Fengrui and Gui, Ping and Ali, Mahboob and others,
    Journal: <\/strong>Journal of molecular cell biology (2020): 462–476<\/p>\n\n\n\n

    Dynamic acetylation of the kinetochore-associated protein HEC1 ensures accurate microtubule–kinetochore attachment
    Authors: <\/strong>Zhao, Gangyin and Cheng, Yubao and Gui, Ping and Cui, Meiying and Liu, Wei and Wang, Wenwen and Wang, Xueying and Ali, Mahboob and Dou, Zhen and Niu, Liwen and others,
    Journal: <\/strong>Journal of Biological Chemistry (2019): 576–592<\/p>\n\n\n\n

    BubR1 phosphorylates CENP-E as a switch enabling the transition from lateral association to end-on capture of spindle microtubules
    Authors: <\/strong>Huang, Yuejia and Lin, Lin and Liu, Xing and Ye, Sheng and Yao, Phil Y and Wang, Wenwen and Yang, Fengrui and Gao, Xinjiao and Li, Junying and Zhang, Yin and others,
    Journal: <\/strong>Cell research (2019): 562–578<\/p>\n\n\n\n

    Methylation of PLK1 by SET7\/9 ensures accurate kinetochore–microtubule dynamics<\/a>
    Authors: <\/strong>Yu, Ruoying and Wu, Huihui and Ismail, Hazrat and Du, Shihao and Cao, Jun and Wang, Jianyu and Ward, Tarsha and Yang, Fengrui and Gui, Ping and Ali, Mahboob and others, undefined
    Journal: <\/strong>Journal of Molecular Cell Biology (2019)<\/p>\n\n\n\n

    ATM-Mediated Phosphorylation of Cortactin Involved in Actin Polymerization Promotes Breast Cancer Cells Migration and Invasion<\/a>
    Authors: <\/strong>Lang, Lei and Hou, Yixuan and Chen, Yanlin and Tu, Gang and Tao, Jing and Yang, Dan and Xi, Lei and Fu, Lixin and Sun, Kexin and Yin, Jiali and others, undefined
    Journal: <\/strong>Cellular Physiology and Biochemistry (2018): 2972–2988<\/p>\n\n\n\n

    Discovery of Non-ATP-Competitive Inhibitors of Polo-like Kinase 1<\/a>
    Authors: <\/strong>Yun, Taikangxiang and Qin, Tan and Liu, Ying and Lai, Luhua
    Journal: <\/strong>ChemMedChem (2016): 713–717<\/p>\n\n\n\n

    Cell polarity kinase MST4 cooperates with cAMP-dependent kinase to orchestrate histamine-stimulated acid secretion in gastric parietal cells<\/a>
    Authors: <\/strong>Jiang, Hao and Wang, Wenwen and Zhang, Yin and Yao, William W and Jiang, Jiying and Qin, Bo and Yao, Wendy Y and Liu, Fusheng and Wu, Huihui and Ward, Tarsha L and others, undefined
    Journal: <\/strong>Journal of Biological Chemistry (2015): 28272–28285<\/p>\n\n\n\n

    Regulation of NDR1 activity by PLK1 ensures proper spindle orientation in mitosis<\/a>
    Authors: <\/strong>Yan, Maomao and Chu, Lingluo and Qin, Bo and Wang, Zhikai and Liu, Xing and Jin, Changjiang and Zhang, Guanglan and Gomez, Marta and Hergovich, Alex and er , undefined and Chen, Zhengjun and others, undefined
    Journal: <\/strong>Scientific reports (2015): 10449<\/p>\n\n\n\n

    <\/div>\n\n\n\n

    Referencias<\/mark><\/p>\n\n\n\n

    Fluorescence detection techniques for protein kinase assay
    Authors: <\/strong>Li Y, Xie W, Fang G.
    Journal: <\/strong>Anal Bioanal Chem (2008): 2049<\/p>\n\n\n\n

    A multiplexed protein kinase assay
    Authors: <\/strong>Shults MD, Kozlov IA, Nelson N, Kermani BG, Melnyk PC, Shevchenko V, Srinivasan A, Musmacker J, Hachmann JP, Barker DL, Lebl M, Zhao C.
    Journal: <\/strong>Chembiochem (2007): 933<\/p>\n\n\n\n

    An enzyme-linked immunosorbent assay for protein kinase D activity using phosphorylation site-specific antibodies
    Authors: <\/strong>Rykx A, Vancauwenbergh S, De Kimpe L, Janssens K, V and oninck S, Waelkens E, V and enheede JR, Van Lint J.
    Journal: <\/strong>Assay Drug Dev Technol (2007): 637<\/p>\n\n\n\n

    Implementation of high-content assay for inhibitors of mitogen-activated protein kinase phosphatases
    Authors: <\/strong>Vogt A, Lazo JS.
    Journal: <\/strong>Methods (2007): 268<\/p>\n\n\n\n

    High-throughput kinase assay based on surface plasmon resonance suitable for native protein substrates
    Authors: <\/strong>Takeda H, Fukumoto A, Miura A, Goshima N, Nomura N.
    Journal: <\/strong>Anal Biochem (2006): 262<\/p>\n\n\n\n

    Assay principle for modulators of protein-protein interactions and its application to non-ATP-competitive ligands targeting protein kinase A
    Authors: <\/strong>Saldanha SA, Kaler G, Cottam HB, Abagyan R, Taylor SS.
    Journal: <\/strong>Anal Chem (2006): 8265<\/p>\n\n\n\n

    Assay development and case history of a 32K-biased library high-content MK2-EGFP translocation screen to identify p38 mitogen-activated protein kinase inhibitors on the ArrayScan 3.1 imaging platform
    Authors: <\/strong>Trask OJ, Jr., Baker A, Williams RG, Nickischer D, K and asamy R, Laethem C, Johnston PA.
    Journal: <\/strong>Methods Enzymol (2006): 419<\/p>\n\n\n\n

    A pull-down assay for 5′ AMP-activated protein kinase activity using the GST-fused protein
    Authors: <\/strong>Kishimoto A, Ogura T, Esumi H.
    Journal: <\/strong>Mol Biotechnol (2006): 17<\/p>\n\n\n\n

    A multiplexed homogeneous fluorescence-based assay for protein kinase activity in cell lysates
    Authors: <\/strong>Shults MD, Janes KA, Lauffenburger DA, Imperiali B.
    Journal: <\/strong>Nat Methods (2005): 277<\/p>\n\n\n\n

    Real-time protein kinase assay
    Authors: <\/strong>Sun H, Low KE, Woo S, Noble RL, Graham RJ, Connaughton SS, Gee MA, Lee LG.
    Journal: <\/strong>Anal Chem (2005): 2043<\/p>\n\n\n\n

    <\/div>\n\n\n\n

    Application Notes (en Ingles)<\/mark><\/p>\n\n\n\n

    A Library of Well-Defined and Water-Soluble Poly(alkyl phosphonate)s with Adjustable Hydrolysis<\/a>
    Acetylcholinesterase Inhibitory Activity of Pigment Echinochrome A<\/a>
    Ameliorative Effect of Novel Vitamin Formula with Herbal Extracts on Scopolamine-Induced Alzheimer’s Disease<\/a>
    An Increase in Plasma Homovanillic Acid with Cocoa Extract Consumption Is Associated with the Alleviation of Depressive Symptoms in Overweight or Obese Adults<\/a>
    Attenuation of lysyl oxidase and collagen gene expression in keratoconus patient corneal epithelium corresponds to disease severity<\/a><\/p>\n\n\n\n

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    Kit de ensayo de quinasa fluorim\u00e9trica universal Amplite\u00ae *Fluorescencia roja* Este kit proporciona un ensayo r\u00e1pido, simple y homog\u00e9neo para medir la actividad de las quinasas. <\/p>\n","protected":false},"featured_media":3134,"template":"","al_product-cat":[34],"aioseo_notices":[],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/nuevo22.cidsamexico.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/al_product\/3130"}],"collection":[{"href":"https:\/\/nuevo22.cidsamexico.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/al_product"}],"about":[{"href":"https:\/\/nuevo22.cidsamexico.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/types\/al_product"}],"version-history":[{"count":7,"href":"https:\/\/nuevo22.cidsamexico.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/al_product\/3130\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":3748,"href":"https:\/\/nuevo22.cidsamexico.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/al_product\/3130\/revisions\/3748"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/nuevo22.cidsamexico.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/media\/3134"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/nuevo22.cidsamexico.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=3130"}],"wp:term":[{"taxonomy":"al_product-cat","embeddable":true,"href":"https:\/\/nuevo22.cidsamexico.com\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/al_product-cat?post=3130"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}