{"id":10012,"date":"2023-04-01T20:27:06","date_gmt":"2023-04-02T02:27:06","guid":{"rendered":"https:\/\/nuevo22.cidsamexico.com\/?post_type=al_product&p=10012"},"modified":"2023-04-03T16:23:19","modified_gmt":"2023-04-03T21:23:19","slug":"hiscube-kit-midi-de-purificacion-de-proteinas-ni-indigo-his-tag","status":"publish","type":"al_product","link":"https:\/\/nuevo22.cidsamexico.com\/index.php\/productos\/hiscube-kit-midi-de-purificacion-de-proteinas-ni-indigo-his-tag\/","title":{"rendered":"HisCube – Kit MIDI de purificaci\u00f3n de prote\u00ednas Ni-INDIGO His-Tag"},"content":{"rendered":"\n
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El kit MIDI de purificaci\u00f3n de prote\u00ednas HisCube His-tag es nuestra forma de proporcionar a su laboratorio un m\u00e9todo conveniente para purificaciones de prote\u00ednas His-tag de alta calidad a peque\u00f1a escala. Ponemos toda nuestra experiencia en purificaciones con etiquetas His en este kit para proporcionar un protocolo f\u00e1cil de seguir.<\/p>\n\n\n\n

El kit HisCube Ni-INDIGO MIDI contiene nuestra resina de agarosa PureCube 100 Ni-INDIGO desarrollada internamente y nuestros tubos giratorios por lotes PureCube 1-Step Batch MIDI.<\/p>\n\n\n\n

La mayor ventaja de INDIGO es su tolerancia a los agentes reductores y quelantes. Estos pueden ser de gran ayuda en las purificaciones de etiquetas de His, pero las perlas de afinidad de etiquetas de His tradicionales no las toleran. EDTA es un quelante que se usa a menudo en tampones de c\u00e9lulas eucariotas porque tiene funciones inhibidoras de proteasas. DTT puede disolver agregados de prote\u00ednas que podr\u00edan dificultar potencialmente el acceso de las perlas de purificaci\u00f3n a las prote\u00ednas marcadas con His. Pero gracias a INDIGO ahora se pueden utilizar ambas sustancias. Por lo tanto, est\u00e1n incluidos en el Kit.<\/p>\n\n\n\n

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Catalogo<\/th>Producto<\/th>Presentaci\u00f3n<\/th><\/tr><\/thead>
CU-80105<\/td>HisCube – Ni-INDIGO His-Tag Protein Purification MIDI Kit<\/td>Kit<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n\n\n
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Protocol HisCube – Ni-INDIGO MIDI Kit\u00a0<\/a><\/a><\/p>\n\n\n\n

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Protocol His-tag Western Blot\u00a0<\/a><\/a><\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n\n\n\n

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Contenido del Kit <\/mark><\/p>\n\n\n\n

2 x 50 ml Binding Buffer<\/a><\/td><\/tr>
2 x 50 ml Wash Buffer<\/a><\/td><\/tr>
1 x 50 ml Elution Buffer<\/a><\/td><\/tr>
1 x 10 ml 100 Ni-INDIGO resin<\/a><\/td><\/tr>
5 x MIDI Spin Columns<\/a><\/td><\/tr>
50 x Collection Tubes<\/td><\/tr>
1 x 500 mM DTT (add 1,016 mL ddH2<\/sub>O)<\/td><\/tr>
1 x 500 mM EDTA (add 0.866 mL ddH2<\/sub>O)<\/td><\/tr>
Print-out of the protocol<\/td><\/tr>
Print-out of the fast protocol<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n\n\n
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Caracteristicas<\/mark><\/p>\n\n\n\n

NI-INDIGO RESIN<\/strong><\/th><\/th><\/tr>
Usage<\/td>Specific binding and purification of 6x His tagged proteins<\/td><\/tr>
Specificity<\/td>Affinity to His-tagged proteins<\/td><\/tr>
Binding capacity<\/td>>100\u202fmg\/mL<\/td><\/tr>
Bead Ligand<\/td>Ni-INDIGO<\/td><\/tr>
Bead size<\/td>100 \u03bcm<\/td><\/tr>
Filling quantity<\/td>Delivered as a 50\u202f% suspension<\/td><\/tr>
pH stability<\/td>2-14<\/td><\/tr>
Chelator stability (e.g. EDTA)<\/td>20mM<\/td><\/tr>
Reducing agent stability (e.g. DTT)<\/td>20mM<\/td><\/tr>
Other stabilities<\/td>100% methanol, 100% ethanol, 8 M urea, 6 M guanidinium hydrochloride, 30% (v\/v) acetonitrile<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n\n\n
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Caracteristicas<\/mark><\/p>\n\n\n\n

PURECUBE MINI BATCH SPIN COLUMN<\/th><\/th><\/tr>
Body material<\/td>Polypropylene<\/td><\/tr>
Filter pore size<\/td>0.1-0.2 \u00b5m low binding PVDF<\/td><\/tr>
Max. volume<\/td>20 ml<\/td><\/tr>
Max. g force<\/td>1,500-2,000 x g (swing-bucket rotor)<\/td><\/tr>
Min. g force<\/td>100-200 x g for 1-10 min<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n\n\n
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Envio y Almacenamiento<\/mark><\/p>\n\n\n\n

Este producto se envia a temperatura ambiente. Almacenamiento a 2-8\u00b0C. <\/p>\n\n\n\n

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Resultado de laboratorio<\/mark><\/p>\n\n\n\n

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Caracter\u00edsticas clave de INDIGO<\/p>\n\n\n\n

INDIGO se desarroll\u00f3 para resolver dos problemas en lo que respecta a las purificaciones de prote\u00ednas con etiquetas His:
La tolerancia a ciertos ingredientes del tamp\u00f3n celular.
La pureza comparativamente baja de las purificaciones con etiqueta His en general
La idea principal era mantener el protocolo de purificaci\u00f3n est\u00e1ndar que se usaba, p. Perlas de Ni-NTA sin cambios. Todo permanece sin cambios, excepto las perlas de agarosa\/perlas magn\u00e9ticas.<\/p>\n\n\n\n

El ligando quelante que es principalmente responsable de las tolerancias frente a los productos qu\u00edmicos, la capacidad y la pureza. Por lo tanto, el objetivo era desarrollar e introducir un ligando que resistiera los reactivos de uso com\u00fan como EDTA, DTT y fenantrolina para brindar al usuario un gran beneficio.<\/p>\n<\/div>\n\n\n\n

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Figura 1: Rendimiento de prote\u00edna etiquetada con His en comparaci\u00f3n con perlas basadas en INDIGO y productos de la competencia con EDTA 20 mM y DTT 10 mM.<\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n\n\n\n

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Resistencia a EDTA y DTT del ligado INDIGO<\/p>\n\n\n\n

La purificaci\u00f3n de prote\u00ednas no se limita a organismos simples como E.coli. Tambi\u00e9n se pueden usar c\u00e9lulas m\u00e1s complejas como c\u00e9lulas de mam\u00edferos o l\u00edneas celulares de insectos para expresar y purificar prote\u00ednas. Estos sistemas vienen con composiciones tamp\u00f3n m\u00e1s complejas y algunos de sus ingredientes pueden interferir con los ligandos IMAC tradicionales. \u00c9stas incluyen:
El EDTA se usa a menudo en tampones de c\u00e9lulas de mam\u00edferos para inhibir cualquier proteasa que pueda disminuir el rendimiento de prote\u00edna. Pero tambi\u00e9n despoja a los ligandos NTA e IDA de sus iones de n\u00edquel, lo que inutiliza las perlas.
DTT, por otro lado, se puede usar para disolver agregados de prote\u00ednas en el lisado celular que podr\u00edan dificultar el acceso a la etiqueta His de la prote\u00edna. Al reducir el n\u00edquel, inutilizando as\u00ed las perlas.
La fenantrolina como inhibidor de la proteasa es un quelante fuerte. Y por lo tanto se comporta de manera similar a EDTA.
Para abordar todos estos problemas, nuestro equipo de I+D desarroll\u00f3 nuestro ligando INDIGO que aumenta la tolerancia a EDTA, DTT y fenantrolina de un procedimiento de purificaci\u00f3n con etiqueta His hasta 20 mM cada uno.<\/p>\n<\/div>\n\n\n\n

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Figura 2: fracciones de eluci\u00f3n de un ensayo de purificaci\u00f3n de etiqueta His utilizando resina de agarosa Ni-INDIGO con EDTA 20 mM en los buffers de purificaci\u00f3n.<\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n\n\n\n

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Pureza de prote\u00edna de INDIGO en comparaci\u00f3n con Ni-NTA y reutilizaci\u00f3n<\/p>\n\n\n\n

Como se mencion\u00f3 anteriormente, los ensayos de purificaci\u00f3n de prote\u00ednas con etiquetas de His pueden quedar rezagados en t\u00e9rminos de pureza en comparaci\u00f3n con otras etiquetas de afinidad. Buenos ejemplos de esto son las etiquetas de afinidad de anticuerpos como FLAG o Rho1D4.<\/p>\n\n\n\n

Por otro lado, las purificaciones FLAG y Rho1D4 dan como resultado cantidades de prote\u00edna muy bajas (hasta 3-4 mg\/ml de resina en el mejor de los casos) y son m\u00e1s adecuadas para prote\u00ednas con baja abundancia.<\/p>\n<\/div>\n\n\n\n

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Figura 3: PureCube 100 Ni-INDIGO Agarose se puede reutilizar varias veces sin regeneraci\u00f3n. Se a\u00f1adi\u00f3 GFP a lisados de E.coli y se purific\u00f3 en ocho al\u00edcuotas en la misma columna de 1 ml rellena con agarosa PureCube 100 Ni-INDIGO. Entre cada ejecuci\u00f3n, la columna se lav\u00f3 brevemente con buffer de carga que conten\u00eda PBS e imidazol 10 mM.<\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n\n\n\n

La purificaci\u00f3n de prote\u00edna con etiqueta His logra los rendimientos de prote\u00edna m\u00e1s altos posibles. En nuestros controles de calidad internos para la resina Ni-INDIGO, normalmente obtenemos alrededor de 100 mg de prote\u00edna por ml de resina. La prote\u00edna utilizada para los controles de calidad es GFP marcada con His. Esta Video-Gu\u00eda muestra la purificaci\u00f3n His-Tag utilizando nuestras perlas His-Affinity. Adem\u00e1s, las perlas INDIGO se pueden reutilizar varias veces, como se muestra en la figura 3. Adem\u00e1s, se pueden regenerar siguiendo este protocolo.<\/p>\n\n\n\n

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Figura 4: PureCube Ni-NTA Agarose es resistente a la oxidaci\u00f3n y regenerable. La agarosa PureCube Ni-NTA se expuso a DTT 5 mM durante 1 h (A). Despu\u00e9s de demostrar que a\u00fan pod\u00eda unirse a GFP (B), la resina se lav\u00f3, se decaparon (C) y se recargaron con Ni2+ (D) siguiendo el protocolo est\u00e1ndar de Cube (ver Protocolos y hojas de datos de Cube).<\/p>\n<\/div>\n\n\n\n

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VIDEOS<\/mark><\/p>\n\n\n\n

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