Kit de ensayo de calcio de punto final sin lavado y sin probenecid Cell Meter™, Esta optimizado para uso en lector de microplacas y permite realizar ensayos homogéneos basados en fluorescencia para detectar la movilización de calcio intracelular sin necesidad de utilizar el modo de lectura cinética.
Descripción
El kit de ensayo de calcio de punto final sin lavado y sin probenecid Cell Meter™ permite realizar ensayos homogéneos basados en fluorescencia para detectar la movilización de calcio intracelular sin necesidad de utilizar el modo de lectura cinética. Se puede usar en lectores de microplacas de fluorescencia con modo de lectura inferior que no tienen un dispensador de líquido incorporado o la capacidad de lectura cinética. Después de cargar el colorante Fluo-8E™AM en las células de interés, sin pasos de lavado, simplemente se puede agregar el agonista de flujo de calcio mediante un dispensador de líquido o pipeteo manual, y luego leer la placa con un lector fluorescente.
Fluo-8E™ AM puede cruzar la membrana celular de forma pasiva por difusión. Una vez dentro de las células, los grupos bloqueadores lipofílicos de Fluo-8E™ AM son escindidos por la esterasa, lo que da como resultado un tinte fluorescente cargado negativamente que permanece dentro de las células. Su fluorescencia es muy mejorada y duradera al unirse al calcio. Cuando las células que expresan GPCR de interés se estimulan con un agonista, el receptor señala la liberación de calcio intracelular, lo que aumenta significativamente la fluorescencia de Fluo-8E™. Las características de su alta sensibilidad, >100 veces mejora la fluorescencia y la señal fluorescente de larga duración hacen de Fluo-8E™ un indicador ideal para la medición de calcio celular en lectores de microplacas de fluorescencia que no tienen la capacidad del modo de lectura cinética y transferencia de fluidos.
El kit de ensayo de calcio de punto final sin lavado y sin probenecid Cell Meter™ se puede realizar en un formato de placa de microtitulación de 96 pozos o de 384 pozos.
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-36312 | Cell Meter™ No Wash and Probenecid-Free Endpoint Calcium Assay Kit | 100 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Lector de Microplacas de Flourescencia
| Excitación | 490 nm |
| Emisión | 525 nm |
| Cutoff | 515 nm |
| Placa recomendada | Paredes negras, fondo claro |
| Especificaciones instrumento | Modo de lectura inferior |
Componentes
| Componente A: Fluo-8E™ AM | 2 viales, liofilizado |
| Componente B: 10X Pluronic® F127 Plus | 1 botella (1 ml) |
| Componente C: HHBS (Hanks’ with 20 mM Hepes) | 1 botella (20 ml) |
Espectro
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Propiedades espectrales
| Factor de corrección (260 nm) | 1.076 |
| Factor de corrección (280 nm) | 0.769 |
| Coeficiente de extinción (cm -1 M -1) | 23430 |
| Excitación (nm) | 495 |
| Emisión (nm) | 516 |
| Rendimiento cuántico | 0.161 |
PREPARACION DE SOLUCION DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
- Solución madre Fluo-8E™ AM:
Agregue 10 µL de DMSO en el vial de Fluo-8E™ AM (Componente A) y mezcle bien. Nota: 10 µL de solución madre Fluo-8E™ AM es suficiente para 50 ensayos (la mitad de la placa de 96 pocillos). Nota: La solución madre de Fluo-8E™ AM sin usar puede dividirse en alícuotas y almacenarse a < -20 oC durante más de un mes si los tubos están sellados herméticamente. Proteger de la luz y evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. - Buffer de ensayo (1X):
Agregue 9 mL de HHBS (Componente C) en 10X Pluronic® F127 Plus (1 mL, Componente B) y mezcle bien. Nota: 10 ml de buffer de ensayo (1X) son suficientes para una placa. Haga alícuotas y almacene el buffer de ensayo 1X no utilizado a < -20 °C. Proteger de la luz y evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación.
PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO
Solución de carga de tinte Fluo-8E™ AM:
Agregue 10 µL de solución madre Fluo-8E™ AM en 5 mL de Tampón de ensayo (1X) y mézclelos bien. Nota: Esta solución de trabajo es estable durante al menos 2 horas a temperatura ambiente.
Para obtener pautas sobre la preparación de muestras de células, visite
https://www.aatbio.com/resources/guides/cell-sample-preparation.html
Imagen
Figura 1. La liberación de calcio intracelular dependiente de la dosis de ATP se midió con el kit de ensayo de calcio de punto final sin lavado y sin probenecid Cell Meter™ en células CHO-K1 en una placa de 96 pozos. Se incubaron 3 columnas de células con solución de carga de colorante Fluo-8E™ AM durante 1 hora a 37 °C antes de agregar ATP a las 3 columnas de los pozos. La placa se leyó inmediatamente después de la adición de ATP por ClarioStar (BMG Labtech) a Ex/Em = 490/525 nm con modo de lectura de punto final y de fondo.
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Bibliografía
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Journal: International Journal of Molecular Sciences (2020): 4626
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Authors: Melkes, Barbora and Markova, Vendula and Hejnova, Lucie and Marek, Ales and Novotny, Jiri
Journal: Biological and Pharmaceutical Bulletin (2020): 908–912
Studies on molecular interactions of the mu-opioid and TRPV1 receptors
Authors: Melkes, Barbora
Journal: (2020)
Referencias
Ver todas las 34 referencias: Citation Explorer
Fluorescence absorbance inner-filter decomposition: the role of emission shape on estimates of free Ca(2+) using Rhod-2
Authors: Territo PR, Heil J, Bose S, Evans FJ, Balaban RS.
Journal: Appl Spectrosc (2007): 138
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Journal: Thorac Cardiovasc Surg (2004): 127
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Authors: Martin VV, Beierlein M, Morgan JL, Rothe A, Gee KR.
Journal: Cell Calcium (2004): 509
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Journal: J Neurosci Methods (2004): 247
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Journal: J Comp Neurol (2000): 297
Application Notes (en Ingles)
A Comparison of Fluorescent Red Calcium Indicators for Detecting Intracellular Calcium Mobilization in CHO Cells
A Meta-Analysis of Common Calcium Indicators
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