Kit de ensayo de Flujo de calcio intracelular Calbryte™ 590 AM. Este ensayo es un método ampliamente utilizado para monitorear las vías de transducción de señales y la detección de alto rendimiento de receptores acoplados a proteína G (GPCR) y objetivos de canales de calcio.
Descripción
El ensayo de flujo de calcio intracelular es un método ampliamente utilizado para monitorear las vías de transducción de señales y la detección de alto rendimiento de receptores acoplados a proteína G (GPCR) y objetivos de canales de calcio. Seguido por Rhod-2 que se introdujo en 1989, Rhod-4 y Cal-590 se desarrollaron más tarde con una relación señal/fondo mejorada, y se convirtieron en los indicadores de Ca2+ fluorescentes rojos ampliamente utilizados para microscopía confocal, citometría de flujo y aplicaciones de detección de alto rendimiento En células CHO y HEK, Rhod-4 y Cal-590 tienen una respuesta de calcio celular que es 10 veces más sensible que Rhod-2 AM. Sin embargo, Cal-590 y Rhod-4 son aún menos sensibles al calcio en las células que los indicadores de calcio fluorescentes verdes correspondientes (p. ej., Fluo-8 y Cal-520).
Calbryte™ 590 es una nueva generación de indicadores fluorescentes rojos para la medición del calcio intracelular. u relación señal/fondo muy mejorada y sus propiedades de retención intracelular hacen de Calbryte™ 590 AM el indicador fluorescente rojo más robusto para evaluar GPCR y canales de calcio, así como para detectar sus agonistas y antagonistas en células vivas. Al igual que otras marcas de colorante AM en células, el Calbryte™ 590 AM éster no es fluorescente y una vez que ingresa a la célula, es hidrolizado por la esterasa intracelular y se activa. El indicador activado es una molécula polar que ya no es capaz de difundirse libremente a través de la membrana celular, esencialmente atrapada dentro de las células.
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-20700 | Calbryte™ 590 AM | 2 x 50 ug |
| AAT-20701 | Calbryte™ 590 AM | 10 x 50 ug |
| AAT-20702 | Calbryte™ 590 AM | 1 mg |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO). Almacenamiento: Congelar a (< -15 °C), Minimizar la exposición a la luz.
Plataforma
Lector de Microplacas de Flourescencia
| Excitación | 540 nm |
| Emisión | 590 nm |
| Corte | 570 nm |
| Placa Recomendada | Paredes negras / fondo claro |
| Especificaciones Instrumento | Modo de lectura inferior / Manejo de líquidos programable |
Microscopio de Flourescencia
| Excitación | TRITC/Cy3 |
| Emisión | TRITC/Cy3 |
| Placa recomendada | Paredes negras / fondo claro |
Espectro
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Propiedades espectrales
| Excitación (nm) | 581 |
| Emisión (nm) | 593 |
PREPARACION DE SOLUCIONES DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Solución madre Calbryte™ 590 AM
Prepare una solución madre de 2 a 5 mM de Calbryte™ 590 AM en DMSO anhidro de alta calidad.
PREPARACION DE SOLUCIONES DE TRABAJO
Solución de trabajo Calbryte™ 590 AM
El día del experimento, disuelva Calbryte™ 590 AM en DMSO o descongele una alícuota de la solución madre indicadora a temperatura ambiente. Prepare una solución de trabajo de tinte de 2 a 20 µM en un buffer de su elección (p. ej., tampón Hanks y Hepes) con Pluronic® F-127 al 0,04 %. Para la mayoría de las líneas celulares, se recomienda Calbryte™ 590 AM a una concentración final de 4 a 5 μM. La concentración exacta de indicadores necesarios para la carga de células debe determinarse empíricamente.
Nota: El detergente no iónico Pluronic® F-127 a veces se usa para aumentar la solubilidad acuosa de Calbryte™ 590 AM. Se puede comprar una variedad de soluciones Pluronic® F-127 de AAT Bioquest.
Nota: Si sus células contienen transportadores de aniones orgánicos, se puede agregar probenecid (1-2 mM) a la solución de trabajo del colorante (la concentración final en el pocillo será de 0.5-1 mM) para reducir la fuga de los indicadores desesterificados. Se puede comprar una variedad de productos de probenecid ReadiUse™, que incluyen sal de sodio soluble en agua y solución estabilizada, en AAT Bioquest.
Calculadora
Preparación de la solución de stock común
Volumen de DMSO necesario para reconstituir la masa específica de Calbryte™ 590 AM a la concentración dada. Tenga en cuenta que el volumen es solo para preparar la solución madre. Consulte el protocolo experimental de muestra para conocer los buffers experimentales/fisiológicos apropiados.
| 0.1 mg | 0.5 mg | 1 mg | 5 mg | 10 mg | |
| 1 mM | 82.05 µL | 410.25 µL | 820.499 µL | 4.102 mL | 8.205 mL |
| 5 mM | 16.41 µL | 82.05 µL | 164.1 µL | 820.499 µL | 1.641 mL |
| 10 mM | 8.205 µL | 41.025 µL | 82.05 µL | 410.25 µL | 820.499 µL |
Imagen
Figura 1. Se midió una dosis-respuesta de ATP en células CHO-K1 con Calbryte™ 590 AM. Se sembraron células CHO-K1 durante la noche a 50.000 células/100 µl/pozo en una placa costar de 96 pocillos de pared negra/fondo transparente. Se añadieron 100 µl de 10 µg/ml de Calbryte™ 590 AM en buffer HH con probenecid y se incubaron durante 60 min a 37 °C. A continuación, la solución de tinte se eliminó y se reemplazó con 200 µl de buffer HH/pozo. FlexStation 3 añadió ATP (50 µl/pocillo) para alcanzar las concentraciones finales indicadas.
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Aplication Notes (en Ingles)
A Comparison of Fluorescent Red Calcium Indicators for Detecting Intracellular Calcium Mobilization in CHO Cells
Calbryte™ 520, Calbryte™ 590 and Calbryte™ 630 Calcium Detection Reagents
Introducing Calbryte™ Series
A Comparison of Fluorescent Red Calcium Indicators for Detecting Intracellular Calcium Mobilization in CHO Cells
Calbryte™ 520, Calbryte™ 590 and Calbryte™ 630 Calcium Detection Reagents