Calbryte™ 520 AM

Kit de ensayo de Flujo de calcio intracelular Mod. Calbryte™ 520 AM. Este es un método ampliamente utilizado para monitorear las vías de transducción de señales y la detección de alto rendimiento de receptores acoplados a proteína G (GPCR) y objetivos de canales de calcio.

Descripción

El ensayo de flujo de calcio intracelular es un método ampliamente utilizado para monitorear las vías de transducción de señales y la detección de alto rendimiento de receptores acoplados a proteína G (GPCR) y objetivos de canales de calcio. Seguido por Fluo-3 que se introdujo en 1989, Fluo-4, Fluo-8 y Cal-520 se desarrollaron más tarde con una relación señal/fondo mejorado y se convirtieron en los indicadores de Ca2+ ampliamente utilizados para microscopía confocal, citometría de flujo y aplicaciones de detección de alto rendimiento. Sin embargo, todavía hay algunos problemas graves con Fluo-4. Por ejemplo, En cuanto a Fluo-3, en la mayoría de los ensayos de calcio intracelular con Fluo-4 AM, se requiere probenecid para evitar que el Fluo-4 cargado en las células se escape de las células. compromete los resultados del ensayo ya que está bien documentado que el probenecid tiene una variedad de efectos celulares complicados. Calbryte™ 520, AM es un nuevo indicador fluorescente y permeable a las células para la medición del calcio intracelular Al igual que otros colorantes esteres AM, Calbryte™ 520 AM no es fluorescente ni activable.

Una vez que Calbryte™ 520 AM ingresa a la célula, es fácilmente hidrolizado por la esterasa intracelular donde se activa y responde al calcio. El indicador activado ahora es una molécula polar que es incapaz de difundirse libremente a través de la membrana celular, esencialmente atrapándolo dentro de la célula. Al unirse a los iones de calcio, Calbryte™ 520 produce una señal de fluorescencia brillante con una relación señal/fondo extremadamente alta. Tiene la misma longitud de onda de excitación y emisión que Fluo-4, por lo que la misma configuración de ensayo de Fluo-4 se puede aplicar fácilmente a los ensayos de calcio basados ​​en Calbryte™ 520. Su relación señal/fondo muy mejorada y sus propiedades de retención intracelular hacen de Calbryte™ 520 AM el indicador más robusto para evaluar los objetivos de los canales de calcio y GPCR, así como para detectar sus agonistas y antagonistas en células vivas.   

CatalogoProductoPresentación
AAT-20650Calbryte™ 520 AM2 x 50 ug
AAT-20651Calbryte™ 520 AM10 x 50 ug
AAT-20653Calbryte™ 520 AM1 mg

Importante: Solo para uso en investigación (RUO). Almacenamiento: Congelar a  (< -15 °C), Minimizar la exposición a la luz.

Plataforma

Lector de Microplacas de Flourescencia

Excitación490 nm
Emisión252 nm
Corte515 nm
Placa RecomendadaParedes negras / fondo claro
Especificaciones InstrumentoModo de lectura inferior / Manejo de líquidos programable

Citómetro de flujo

Laser de Excitación488 nm
Filtro de Emisión530/30 nm
Especificaciones instrumentoCanal FITC

Microscopio de Flourescencia

ExcitaciónFITC
EmisiónFITC
Placa recomendadaParedes negras / fondo claro

Espectro

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Propiedades espectrales

Excitación (nm)493
Emisión (nm)515
Rendimiento cuántico0.751
1 Calcium bound (pH 7.2)
PREPARACION DE SOLUCIONES DE STOCK

A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.

Solución madre Calbryte™ 520 AM
Prepare una solución madre de 2 a 5 mM de Calbryte™ 520 AM en DMSO anhidro.


PREPARACION DE SOLUCIONES DE TRABAJO

Solución de trabajo Calbryte™ 520 AM
El día del experimento, disuelva Calbryte™ 520 AM en DMSO o descongele una alícuota de la solución madre indicadora a temperatura ambiente. Prepare una solución de trabajo de tinte de 2 a 20 µM en un buffer de su elección (p. ej., Hanks y Hepes) con Pluronic® F-127 al 0,04 %. Para la mayoría de las líneas celulares, se recomienda Calbryte™ 520 AM a una concentración final de 4 a 5 μM. La concentración exacta de indicadores necesarios para la carga de células debe determinarse empíricamente.


Nota: El detergente no iónico Pluronic® F-127 a veces se usa para aumentar la solubilidad acuosa de Calbryte™ 520 AM. Se puede comprar una variedad de soluciones Pluronic® F-127 de AAT Bioquest.
Nota: Si sus células contienen transportadores de aniones orgánicos, se puede agregar probenecid (1-2 mM) a la solución de trabajo del colorante (la concentración final en el pocillo será de 0,5-1 mM) para reducir la fuga de los indicadores desesterificados. Se puede comprar una variedad de productos de probenecid ReadiUse™, que incluyen sal de sodio soluble en agua y solución estabilizada, en AAT Bioquest.

Calculadora

Preparación de la solución de stock común
Volumen de DMSO necesario para reconstituir la masa específica de Calbryte™ 520 AM a la concentración dada. Tenga en cuenta que el volumen es solo para preparar la solución madre. Consulte el protocolo experimental de muestra para conocer los buffers experimentales/fisiológicos apropiados.

0.1 mg0.5 mg1 mg5 mg10 mg
1 mM91.667 µL458.337 µL916.674 µL4.583 mL9.167 mL
5 mM18.333 µL91.667 µL183.335 µL916.674 µL1.833 mL
10 mM9.167 µL45.834 µL91.667 µL458.337 µL916.674 µL

Imagenes

Fig. 1

Figura 1. La respuesta de ATP se midió en células CHO-K1 usando Calbryte™ 520 AM (Cat No. 20653) y Fluo-4, AM (Cat No. 20550). Se sembraron células CHO-K1 50.000 células/100 µl/pozo durante la noche a en una placa costar de 96 pocillos de pared negra/fondo transparente. Se añadieron a los pozos 100 µl de 10 µg/ml de Calbryte™ 520 AM en buffer HH con probenecid o 10 µg/ml de Fluo-4, AM en buffer HH con probenecid y se incubaron durante 45 minutos a 37 °C. Ambas soluciones de carga de tinte se eliminaron y se reemplazaron con 200 µl de buffer HH/pocillo. Se añadió ATP (50 µl/pocillo) para lograr la concentración final indicada de 10 µM. Las imágenes fueron adquiridas en un microscopio Keyence en el canal FITC.

Fig. 2

Figura 2. La respuesta a la dosis de carbacol se midió en células CHO-M1 con Calbryte™ 520 AM y Fluo-4 AM. Se sembraron células CHO-M1 durante la noche a 50.000 células/100 µl/pocillo en una placa costar de 96 pocillos de pared negra/fondo transparente. Se añadieron 100 µl de 10 µg/ml de Calbryte™ 520 AM en buffer HH o 10 µg/ml de Fluo-4 en buffer HH y se incubaron durante 45 minutos a 37 °C. A continuación, la solución de carga de tinte se eliminó y se reemplazó con 200 µl de buffer HH/pocillo. FlexStation 3 añadió carbacol (50 µl/pocillo) para alcanzar las concentraciones finales indicadas.

Formatos Alternativos

Cell Meter™ Fluorimetric Intracellular Total ROS Activity Assay Kit*Green Fluorescence*
Cell Meter™ Fluorimetric Intracellular Total ROS Activity Assay Kit*Orange Fluorescence*
Cell Meter™ Fluorimetric Intracellular Total ROS Activity Assay Kit*Red Fluorescence*
Cell Meter™ Fluorimetric Intracellular Total ROS Activity Assay Kit*Optimized for Flow Cytometry*

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1 Calcium bound (pH 7.2)

Bibliografía

Ver todas las 166 bibliografias: Citation Explorer

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Referencias

Ver todas las 63 referencias: Citation Explorer

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Aplication Notes (en Ingles)

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