Kit de ensayo rápido para la diferencia glutatión GSH/GSSG fuorométrica Amplite®, Nuestro kit proporciona un ensayo ultrasensible para cuantificar el GSH en la muestra y utiliza un tinte no fluorescente soluble en agua patentado que se vuelve fuertemente fluorescente al reaccionar con el tiol.
Descripción
Cuando las células se exponen a mayores niveles de estrés oxidativo, el GSSG se acumulará y la proporción de GSH a GSSG disminuirá. el glutatión redutasa recicla GSSG a GSH con oxidación simultánea de b-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato. El seguimiento de la relación GSH/GSSG y la cuantificación de GSSG en muestras biológicas son esenciales para evaluar el estado redox y de desintoxicación de células y tejidos en relación con el papel protector del glutatión frente a la lesión celular oxidativa y mediada por radicales libres. Hay algunos reactivos o kits de ensayo disponibles para la cuantificación de tioles en sistemas biológicos. Sin embargo, todos los kits comerciales carecen de sensibilidad o tienen protocolos tediosos.
Nuestro kit proporciona un ensayo ultrasensible para cuantificar el GSH en la muestra. El kit utiliza un tinte no fluorescente soluble en agua patentado que se vuelve fuertemente fluorescente al reaccionar con el tiol. El kit proporciona un método fluorométrico sensible de un solo paso para detectar tan solo 1 picomol de cisteína o GSH en un volumen de ensayo de 100 µL. El ensayo se puede realizar en un conveniente formato de placa de microtitulación de 96 pozos o de 384 pozos y se puede adaptar fácilmente a la automatización sin un paso de separación. Su señal se puede leer fácilmente con un lector de microplacas de fluorescencia.
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-10060 | Amplite® Rapid Fluorimetric Glutathione GSH/GSSG Ratio Assay Kit *Green Fluorescence* | 200 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Lector de Microplacas de Fluorescencia
| Excitación | 490 nm |
| Emisión | 525 nm |
| Cutoff | 515 nm |
| Placa recomendada | Negra sólida |
Componentes
| Componente A: Thiolite™ Green 520WS | 1 vial |
| Componente B: Buffer de ensayo | 1 botella (25 mL) |
| Componente C: Estandar GSH | 1 vial (62 µg) |
| Componente D: GSSG Probe | 1 botella (polvo liofilizado) |
| Componente E: GSSG Standard | 1 vial (124 µg) |
PREPARACION DE SOLUCION DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
1. Solución estándar de GSH (1 mM)
Agregue 200 µl de buffer de ensayo (componente B) en el vial de estándar de GSH (componente C) para preparar una solución estándar de GSH de 1 mM (1 nmol/µl).
2. Solución estándar de GSSG (1 mM)
Agregue 200 µL de ddH2O en el vial de GSSG Standard (Componente E) para preparar una solución estándar de GSSG de 1 mM (1 nmol/µL).
3. Solución madre de Thiolite™ Green 520WS (100X)
Agregue 100 µL de ddH2O en el vial de Thiolite™ Green 520WS (Componente A) para preparar una solución madre de Thiolite™ Green 520WS 100X. Nota: Evite la luz.
PREPARACION DE SOLUCION DE ESTANDAR
Para su conveniencia puede usar el Planificador de dilución en serie: https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/10060
Estándar GSH o GSSG
Estándares de GSH diluidos en serie preparados (0 a 10 µM): agregue 10 µL de solución estándar de GSH de 1 mM (1 nmol/µL) a 990 µL de buffer de ensayo (componente B) para generar una solución estándar de GSH de 10 µM (10 pmol/µL) (GSH7). Tome 10 µM (10 pmol/µL) de solución estándar de GSH (GSH7) y realice diluciones en serie 1:2 en buffer de ensayo (componente B) para obtener estándares de GSH diluidos en serie (GSH6 – GSH1). Nota: La solución estándar de GSH diluida es inestable. Úselo dentro de las 4 horas. Prepare estándares de GSSG diluidos en serie (0 a 5 µM): agregue 10 µL de solución estándar de GSSG de 1 mM (1 nmol/µL) a 990 µL de buffer de ensayo (componente B) para generar una solución estándar de GSSG de 10 µM (10 pmol/µL) . Tome una solución estándar de GSSG de 10 µM (10 pmol/µL) y realice diluciones en serie 1:2 en buffer de ensayo (componente B) para obtener estándares de GSSG diluidos en serie (GSSG7 – GSSG1). Nota: La solución estándar de GSSG diluida es inestable. Úselo dentro de las primeras 4 horas.
PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO
- Solución de trabajo GSH (GSH-WS)
Agregue 100 µL de solución madre de Thiolite™ Green 520WS 100X en 10 mL de buffer de ensayo (Componente B) y mezcle bien mediante agitación vorticial.
Nota: Esta solución de trabajo de GSH (GSH-WS) es suficiente para dos placas de 96 pocillos. Es estable a 4 °C durante al menos 4 horas protegido de la luz.
- Solución de trabajo de GSH total (TGSH-WS) .
Agregue 5 mL de GSH-WS en la botella de GSSG Probe (Componente D) y mézclelos bien. Nota: Esta solución de trabajo de GSH total (TGSH-WS) es suficiente para una placa de 96 pocillos. Es inestable a temperatura ambiente y se debe usar de inmediato dentro de las primeras 2 horas.
Nota: Evite la exposición a la luz.
Nota: Como alternativa, se puede hacer una sonda GSSG 25X agregando 200 µL de ddH2O en la botella de la sonda GSSG (componente D) y luego preparar el TSGS-WS mezclando la solución madre con GSH-WS proporcionalmente.
Imagen
Figura 1. Las respuestas a la dosis de GSH y GSSG se midieron con el kit de ensayo de relación de glutatión GSH/GSSG fluorimétrico rápido Amplite®. Azul: respuestas a la dosis de GSH (0,078 a 5 µM); Rojo: respuesta a la dosis de GSSG (0,078 a 5 µM GSSG que equivale a 0,156 a 10 µM GSH).
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