Kit de ensayo fluorométrico de lisil oxidasa Amplite® *Fluorescencia roja*. Este kit ofrece un ensayo fluorescente sensible para medir la actividad de LOX utilizando nuestro sustrato LOX patentado que libera peróxido de hidrógeno tras la oxidación de LOX.
Descripción
La lisil oxidasa (LOX) es una enzima extracelular que cataliza la formación de aldehídos a partir de residuos de lisina en precursores de colágeno y elastina. Estos aldehídos son altamente reactivos y experimentan reacciones químicas espontáneas con otros residuos de aldehídos derivados de la lisil oxidasa o con residuos de lisina sin modificar. Esto da como resultado el entrecruzamiento del colágeno y la elastina, lo cual es esencial para la estabilización de las fibrillas de colágeno y para la integridad y elasticidad de la elastina madura. La lisil oxidasa se ha identificado como un posible supresor de tumores. La actividad de la lisil oxidasa en muestras biológicas se evalúa tradicionalmente y de forma más fiable mediante ensayos de punto final de liberación de tritio utilizando sustratos de elastina o colágeno radiomarcados que implican una laboriosa destilación al vacío del agua tritiada liberada.
Este kit ofrece un ensayo fluorescente sensible para medir la actividad de LOX utilizando nuestro sustrato LOX patentado que libera peróxido de hidrógeno tras la oxidación de LOX. La cantidad de peróxido de hidrógeno liberado por la oxidación de LOX se detecta utilizando nuestro sustrato Amplite® HRP en las reacciones acopladas a HRP. Este método permite la detección de lisil oxidasa por debajo de ng/mL y es mucho más sensible que el ensayo fluorométrico actualmente disponible para esta actividad enzimática. Este método elimina la interferencia que se produce en algunas muestras biológicas y se puede utilizar fácilmente para detectar la actividad de la lisil oxidasa en experimentos de cultivos celulares.
Tenga en cuenta que el kit no incluye la enzima lisil oxidasa.
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-15255 | Amplite® Fluorimetric Lysyl Oxidase Assay Kit *Red Fluorescence* | 500 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Lector de Microplacas de Fluorescencia
| Excitación | 540 nm |
| Emisión | 590 nm |
| Cutoff | 570 nm |
| Placa recomendada | Pared negra |
Componentes
| Componente A: Amplite™ HRP Substrate (sensible a la luz) | 1 vial |
| Componente B: Buffer de ensayo | 1 botella (50 mL) |
| Componente C: Horseradish Peroxidase | 1 vial (50 unidades) |
| Componente D: DMSO | 1 vial (200 µL) |
Espectro
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Propiedades Espectrales
| Excitación (nm) | 571 |
| Emisión (nm) | 584 |
PREPARACION DE SOLUCION DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
- Solución madre de sustrato Amplite™ HRP (250X)
Agregue 100 µl de DMSO (componente D) en el vial de sustrato Amplite™ HRP (componente A).
Nota El sustrato Amplite™ HRP es inestable en presencia de tioles como DTT, glutatión (forma reducida: GSH) y β-mercaptoetanol. La presencia de tioles a una concentración superior a 10 µM disminuirá significativamente el rango dinámico del ensayo. Algunos detergentes (como Brij-35, Tween-20 y NP40), NADH y NADPH también pueden interferir con este ensayo. - Solución madre de peroxidasa de rábano picante (50 U/mL)
Agregue 1 ml de tampón de ensayo (componente B) al vial de peroxidasa de rábano picante (componente C).
PREPARACION DE SOLUCION DE ESTANDAR
Para su conveniencia puede usar el Planificador de dilución en serie:
https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/15255
Estándar de lisil oxidasa
Prepare estándares de lisil oxidasa por dilución en serie para obtener estándares de 0,04 a 4 µg/mL (LS1 – LS7). Nota: El estándar de lisil oxidasa no se incluye en este kit. Se puede comprar en R&D Sytems (2639-AO-010 o 6069-AO-010).
PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO
Solución de trabajo de sustrato Amplite™ HRP
Agregue 20 μL de solución madre de sustrato Amplite™ HRP (250X) y 20 μL de peroxidasa de rábano picante (50 U/mL) en 5 mL de buffer de ensayo (componente B) para obtener un volumen total de 5.04 mL.
Nota: La solución de trabajo no es estable, utilícela inmediatamente y evite la exposición directa a la luz.
Imagenes
Figura 1. La respuesta a la dosis de lisil oxidasa se midió con el kit de ensayo fluorométrico de lisil oxidasa Amplite® en una placa negra sólida de 96 pozos utilizando un lector de microplacas de fluorescencia Gemini (Molecular Devices).
Figura 2. Efecto de la inhibición de LOX sobre la activación inflamatoria de EC inducida por LPS. EC pulmonar humana cultivada en 2,8 (300 µM) y luego estimulada con LPS (200 ng/ml) durante 48 horas con o sin BAPN. A – La producción de IL-8 por EC estimulada con o sin BAPN fue evaluada en medio acondicionado por ensayo ELISA; *P<0,05. B: la expresión de ICAM-1 y VCAM-1 se determinó mediante análisis de transferencia Western con anticuerpos específicos. C: la expresión de ICAM-1 se examinó mediante tinción de inmunofluorescencia de EC estimulada con el anticuerpo ICAM-1 (verde). Se usó una contratinción con DAPI (azul) para visualizar los núcleos celulares. D: las HPAEC se transfectaron con ARNsi no específico (nsRNA) o específico de LOX (si-LOX). La expresión de ICAM-1 se determinó por western blot. La carga igual de proteína se confirmó mediante un nuevo sondeo de membrana con anticuerpo de β-actina. La actividad LOX y la producción de interleucina-8 (IL-8) en medio acondicionado se midieron mediante el ensayo de actividad LOX (AAT Bioquest, Sunnyvale, CA) y el kit ELISA IL-8 (R&D Systems), respectivamente, según los fabricantes. ‘ instrucciones. Fuente: Gráfico de la expresión GEF-H1 activada por rigidez exacerba la inflamación pulmonar inducida por LPS de Isa Mambetsariev et al., PLOS, abril de 2014.
Figura 3. Efectos de IL1β y TGFβ1 sobre la expresión y nivel de actividad de lisil oxidasa en fibroblastos dérmicos y pulmonares. (A-B) HDFa y HLFa se trataron con IL1β, TGFβ1 o una combinación de ambos, durante 24 y 48 h. Los niveles de ARNm de LOX se midieron con qRT-PCR y se expresaron como cambio de veces en comparación con el control no tratado. (C–D) Cuantificación de la actividad de lisil oxidasa secretada en el medio de cultivo por HDFa y HLFa tratados con IL1β, TGFβ1 o una combinación de ambos durante 24 y 48 h. La actividad LOX se determinó con el kit de ensayo fluorimétrico de lisil oxidasa Amplite (AAT Bioquest Inc, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Fuente: Gráfico de Interleukin-1β Attenuates Myofibroblast Formation and Extracelular Matrix Production in Dérmal and Lung Fibroblasts Exposed to Transforming Growth Factor-β1 por Masum M et al., PLOS, marzo de 2014.
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BIbliografía
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Referencias
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