Kit de ensayo de relación de glutatión GSH/GSSG fluorimétrico Amplite®. Nuestro kit proporciona un ensayo ultrasensible para cuantificar el GSH en la muestra. El kit utiliza un tinte no fluorescente patentado que se vuelve fuertemente fluorescente al reaccionar con el tiol.
Descripción
Cuando las células se exponen a mayores niveles de estrés oxidativo, el GSSG se acumulará y la proporción de GSH a GSSG disminuirá. La glutatión redutasa recicla GSSG a GSH con oxidación simultánea de b-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato. El seguimiento de la relación GSH/GSSG y la cuantificación de GSSG en muestras biológicas son esenciales para evaluar el estado redox y de desintoxicación de células y tejidos en relación con el papel protector del glutatión frente a la lesión celular oxidativa y mediada por radicales libres. Hay algunos reactivos o kits de ensayo disponibles para la cuantificación de tioles en sistemas biológicos. Sin embargo, todos los kits comerciales carecen de sensibilidad o tienen protocolos tediosos.
Nuestro kit de relación GSH/GSSG fluorimétrico Amplite® proporciona un ensayo ultrasensible para cuantificar el GSH en la muestra. El kit utiliza un tinte no fluorescente patentado que se vuelve fuertemente fluorescente al reaccionar con el tiol. El kit proporciona un método fluorimétrico sensible de un solo paso para detectar tan solo 1 picomol de cisteína o GSH en un volumen de ensayo de 100 µL. El ensayo se puede realizar en un conveniente formato de placa de microtitulación de 96 pocillos o de 384 pocillos y se puede adaptar fácilmente a la automatización sin un paso de separación. Su señal se puede leer fácilmente con un lector de microplacas de fluorescencia.
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-10056 | Amplite® Fluorimetric Glutathione GSH/GSSG Ratio Assay Kit *Green Fluorescence* | 200 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Lector de Microplacas de Fluorescencia
| Excitación | 490 nm |
| Emisión | 520 nm |
| Cutoff | 510 nm |
| Placa recomendada | Pared negra |
Componentes
| Componente A: Thiolite™ Green | 1 vial |
| Componente B: Buffer de ensayo | 1 botella (25 mL) |
| Componente C: Estandar GSH | 1 vial (62 µg) |
| Componente D: DMSO | 1 vial (400 µL) |
| Componente E: GSSG Probe | 1 botella (polvo liofilizado) |
| Componente F: GSSG Standard | 1 vial (124 µg) |
PREPARACION DE SOLUCION DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
1. Solución estándar de GSH (1 mM)
Agregue 200 µl de buffer de ensayo (componente B) en el vial de estándar de GSH (componente C) para preparar una solución estándar de GSH de 1 mM (1 nmol/µl).
2. Solución estándar de GSSG (1 mM)
Agregue 200 µL de ddH2O en el vial de GSSG Standard (Componente F) para preparar una solución estándar de GSSG de 1 mM (1 nmol/µL).
3. Solución madre de Thiolite™ Green (100X)
Agregue 100 µL de DMSO (Componente D) en el vial de Thiolite™ Green (Componente A) para preparar una solución madre de Thiolite™ Green 100X. Nota: Se pueden agregar 200 µL de DMSO para hacer una solución madre de 50 X Thiolite™ Green para una mejor solubilidad.
PREPARACION DE SOLUCION DE ESTANDAR
Para su conveniencia puede usar el Planificador de dilución en serie:
https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/10056
Estándar GSH o GSSG
Prepare estándares de GSH diluidos en serie (0 a 10 μM): agregue 10 μL de solución madre estándar de GSH a 990 μL de buffer de ensayo (componente B) para generar una solución estándar de GSH 10 μM (GSH7). Nota: La solución estándar de GSH diluida es inestable. Úselo dentro de las primeras 4 horas. Tome una solución estándar de GSH de 10 μM para realizar diluciones en serie 1:2 para obtener 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 y 0,1563 estándares de GSH diluidos en serie (GSH6-GSH1). Prepare estándares de GSSG diluidos en serie (0 a 5 μM): agregue 10 μL de solución estándar de GSSG en 990 μL de buffer de ensayo (componente B) para generar una solución estándar de GSSG de 10 μM. Nota: La solución estándar de GSSG diluida es inestable. Úselo dentro de las primeras 4 horas. Tome una solución estándar de GSSG de 10 μM para realizar diluciones en serie 1:2 para obtener 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125, 0,1563 y 0,0781 estándares de GSSG diluidos en serie (GSSG7-GSSG1).
PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO
- Solución de trabajo GSH (GSH-WS)
Agregue 100 μL de solución madre de Thiolite™ Green 100X en 10 mL de buffer de ensayo (componente B) y mezcle bien mediante agitación vorticial. Nota: Esta solución de trabajo de GSH (GSH-WS) es suficiente para dos placas de 96 pocillos. Es inestable a temperatura ambiente y se debe usar de inmediato dentro de las primeras 2 horas. Nota: Evite la exposición a la luz.
Nota Como alternativa, se puede preparar una solución de trabajo de GSH agregando una solución madre de Thiolite™ Green 100X con buffer de ensayo proporcionalmente.
2. Solución de trabajo de GSH total (TGSH-WS)
Agregue 5 ml de GSH-WS a la botella de sonda GSSG (componente E) y mézclelos bien con vórtex. Nota: Esta solución de trabajo de GSH total (TGSH-WS) es suficiente para una placa de 96 pocillos. Es inestable a temperatura ambiente, y debe usarse con prontitud dentro de las primeras 2 horas y evitar la exposición a la luz. Nota: Como alternativa, se puede hacer una sonda GSSG 25X agregando 200 μL de ddH2O en la botella del Componente E y luego preparar el TGSH-WS mezclando la solución madre con GSH-WS proporcionalmente.
Imagen
Figura 1. Las respuestas de dosis de GSH y total (GSH+GSSG) se midieron con el kit de ensayo de relación de glutatión GSH/GSSG fluorimétrico Amplite®. Línea azul: solo en presencia de GSH; Línea roja: en presencia de 1:1 GSH/GSSG.
Bibliografía
Ver las 14 bibliografías: Citation Explorer
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