Kit de cuantificación de maleimida colorimétrica, Amplite®. Este ensayo espectrofotométrico para la determinación de grupos maleimida es un ensayo GSH inverso.
Descripción
Las maleimidas se pueden analizar directamente espectrofotométricamente a 302 nm. Sin embargo, el pequeño coeficiente de extinción de 620 M-1cm-1 hace que este ensayo sea insensible y se complica aún más por la absorbancia de la proteína a la misma longitud de onda. Este kit de ensayo colorimétrico de maleimida cuantifica los grupos de maleimida haciendo reaccionar primero una muestra con una cantidad conocida de tiol presente en exceso y luego analizando el tiol restante sin reaccionar usando 4,4\’-DTDP con un coeficiente de extinción molar de 19,800 M -1cm-1. La cantidad de maleimida se calcula como la diferencia entre la cantidad inicial de tiol y la cantidad de tiol sin reaccionar después de la reacción completa de todos los grupos maleimida.
Este ensayo espectrofotométrico para la determinación de grupos maleimida es un ensayo GSH inverso. Se aprovecha de la alta reactividad de los tioles de GSH con el resto maleimida. Se permite que la maleimida de la muestra forme un enlace tiosuccinimidil estable con GSH. Una vez completada la reacción de la muestra, se estima el exceso de GSH, es decir, los tioles restantes de GSH en la mezcla de reacción, usando 4,4\’-DTDP. La cantidad de GSH que reacciona con la muestra se titula para determinar la cantidad de maleimida. Para una cuantificación de maleimida más sensible, le recomendamos que utilice nuestro kit fluorimétrico catalogo 5523 que tiene una mayor sensibilidad.
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-5525 | Amplite® Colorimetric Maleimide Quantitation Kit | 100 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Lector de Microplacas de Absorbancia
| Absorbancia | 324 nm |
| Placa recomendada | Fondo claro |
Componentes
| Component A: MEA | 1 vial |
| Component B: 4,4′-DTDP | 1 vial |
| Component C: Buffer de ensayo | 1 botella (50 mL) |
| Component D: DMSO | 1 vial (1 mL) |
PREPARACION DE SOLUCIONES DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
1. Solución madre MEA (500X)
Agregue 200 µL de agua destilada al vial de MEA (Componente A). Nota: 10 µL de la solución madre 500X MEA es suficiente para 50 reacciones (0,5 mL/reacción). La solución madre de 500X MEA no utilizada debe dividirse en alícuotas de un solo uso, almacenarse a -20 oC y protegerse de la luz.
2. Solución madre de 4,4′-DTDP (50X)
Agregue 1 mL de DMSO (Componente D) en el vial de 4,4′-DTDP (Componente B) y mezcle bien. Nota: 100 µL de la solución madre 50X 4,4’-DTDP es suficiente para 10 reacciones (0,5 mL/reacción). La solución madre de 50X 4,4′-DTDP no utilizada debe dividirse en alícuotas de un solo uso, almacenarse a -20 oC y protegerse de la luz.
PREPARACION DE SOLUCIONES DE TRABAJO
MEA Working Solution
Agregue 10 μL de solución madre de MEA (500X) en 5 mL de agua destilada y mezcle bien. Nota: La solución de trabajo MEA no es estable. Recomendamos prepararla al momento antes de usar.
Imagen
Figura 1. Estructura química del kit de cuantificación de maleimida colorimétrica Amplite®.
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