Ensayos de viabilidad celular

Los ensayos de viabilidad celular utilizan una variedad de marcadores para determinar con precisión las células sanas y vivas dentro de poblaciones complejas. Se utilizan ampliamente en pruebas de citotoxicidad y descubrimiento de fármacos para medir la salud de las células en respuesta a estímulos extracelulares, evaluar la eficacia de nuevas terapias y la sensibilidad de las líneas celulares a agentes específicos. Más importante aún, los ensayos de viabilidad optimizan el crecimiento y las condiciones experimentales en el cultivo celular para garantizar datos de alta calidad que sean sólidos y reproducibles.

AAT Bioquest ofrece una amplia gama de reactivos y ensayos de viabilidad basados en colorimetría, fluorescencia y bioluminiscencia para detectar parámetros exclusivos de células vivas metabólicamente activas. Estos incluyen ensayos para medir la integridad de la membrana, la actividad enzimática y metabólica, la concentración de ATP y el potencial de la membrana mitocondrial. Además de los ensayos de viabilidad celular para lecturas de un solo parámetro, ofrecemos ensayos de viabilidad celular Live or Dead™ para medir simultáneamente células vivas y muertas en función de la integridad de la membrana y la actividad metabólica.

Descripción general de los ensayos de viabilidad celular

Parámetro	Ansayo/Reactivo	Método	Instrumento	Principio
Integridad de la Membrana	Trypan Blue vital stains	Colorimétrico	Hemocitómetro	Trypan Blue, Trypan UltraBlue™, Trypan Red Plus™, y Trypan Purple™ son colorantes vitales impermeables a la membrana. Las células vivas con la integridad de la membrana intacta excluyen estos tintes y permanecen sin teñir, mientras que las células muertas no lo hacen. El porcentaje de células viables es igual al número de células no teñidas dividido por el número total de células (teñidas y no teñidas) multiplicado por 100.
	Membrane-Impermeant DNA dyes	Fluorescencia	FC, FM, or MR	Colorantes de ADN permeables a las células, como propidium iodide, 7-AAD, o Nuclear DCS1™ dyes, ingresan a las células muertas con membranas comprometidas, por lo que se unen al ADN y emiten una intensa fluorescencia. Las células viables excluyen estos tintes y permanecen sin teñir.
	Cell Meter™ Fixable Viability dyes	Fluorescencia	FC or FM	Colorantes impermeables a las células, reactivos con aminas: en células vivas, los colorantes de viabilidad fijable Cell Meter™ se unen a las aminas primarias en las proteínas de la superficie celular y emiten una fluorescencia tenue. En las células muertas con membranas dañadas, estos tintes ingresan al citoplasma y se unen a muchos grupos amino intracelulares, lo que produce una fluorescencia significativa. La diferencia de intensidad de fluorescencia le permite discriminar entre células vivas y muertas.
Actividad Enzimatica	Calcein AM dyes	Fluorescencia	FC, FM, or MR	Sustratos de esterasa fluorogénica permeables a las células para identificar células vivas. Estos sustratos se difunden libremente y de forma no invasiva a través de la membrana plasmática de las células vivas. Una vez dentro, las esterasas citosólicas en las células activas hidrolizan rápidamente los sustratos de calceína AM no fluorescentes en productos de calceína fluorescentes brillantes retenidos por células vivas con membranas plasmáticas intactas. La intensidad de la fluorescencia es proporcional al número de células viables.
Actividad Metabolica	Tetrazolium dyes (WST and MTT)	Colorimétrico	MR	Los sustratos cromogénicos miden el potencial de reducción celular en células metabólicamente activas para evaluar la viabilidad. Las deshidrogenasas y reductasas activas en células sanas y vivas reducen los tintes de tetrazolio de un complejo incoloro a un producto de formazán de color púrpura brillante. La absorbancia se mide a OD = 570 nm para determinar la viabilidad.
Actividad Metabolica	Resazurin	Colorimétrico o fluorescencia	MR	La resazurina es un indicador de oxidación-reducción. En las células metabólicamente activas, la resazurina se reduce mediante la respiración aeróbica a resorufina, un producto rosa y muy fluorescente. La señal producida por la resorufina es proporcional al número de células viables y se puede medir con instrumentos fluorescentes o colorimétricos.
Concentración ATP	PhosphoWorks™ ATP assays	Colorimétrico, fluorescencia, o luminescencia	MR	Los ensayos PhosphoWorks™ Luminometric ATP aprovechan la reacción de luciferina-luciferasa, que utiliza ATP para producir fotones de luz. La intensidad de la señal luminiscente es proporcional a la concentración de ATP y al número de células viables. El ensayo PhosphoWorks™ Colorimetric ATP y el ensayo PhosphoWorks™ Fluorimetric ATP utilizan reacciones acopladas a enzimas inducidas por ATP en serie para producir peróxido de hidrógeno, que se cuantifica espectrofotométricamente usando un sustrato cromogénico o fluorógeno, respectivamente. En ambos escenarios, la intensidad de la señal es proporcional a la concentración de ATP y al número de células viables.
Concentración ATP	ReadiUse™ ATP assays	Luminescencia	MR	Los ensayos ReadiUse™ Luminometric ATP aprovechan la reacción de luciferina-luciferasa, que utiliza ATP para producir fotones de luz. La intensidad de la señal luminiscente es proporcional a la concentración de ATP y al número de células viables.

Medición de la integridad de la membrana plasmática

La integridad de la membrana plasmática es el parámetro más ampliamente medido para determinar la viabilidad celular. Estos métodos se basan en el principio de que las células viables tienen membranas plasmáticas intactas y son impermeables a los colorantes polares, mientras que las células muertas no lo son. La integridad comprometida de la membrana de las células muertas permite que estos colorantes penetren en la membrana y tiñen los componentes intracelulares, como los ácidos nucleicos y las proteínas. A continuación, las células muertas teñidas se pueden identificar y eliminar del análisis final seleccionando la población de células vivas no teñidas. Los colorantes de integridad de membrana son fáciles de usar, fiables y se pueden combinar con sustratos de esterasa intracelular, colorantes sensibles al potencial de membrana y sondas de orgánulos para análisis multiplex. Los tintes de integridad de membrana comunes incluyen tintes vitales de azul de tripano, tintes de unión de ácido nucleico y tintes de viabilidad reactivos con amina.

Ensayos de exclusión de colorante azul tripano

El ensayo de exclusión con colorante azul tripano es uno de los primeros y más comunes métodos para medir la viabilidad celular. El azul de tripano es una tinción impermeable a la membrana que penetra selectivamente en las células muertas y se une a las proteínas intracelulares, lo que hace que su citoplasma sea azul. Las suspensiones de células analizadas con azul de tripán idealmente muestran dos lecturas, poblaciones de células vivas con citoplasmas claros y poblaciones de células muertas con citoplasmas azules. Estos se pueden identificar y contar fácilmente mediante microscopía óptica. Si bien los ensayos de exclusión con colorante azul tripán son económicos y sencillos de realizar, el azul tripán se reconoce como carcinógeno y debe manejarse con cuidado y desecharse adecuadamente. Trypan UltraBlue™, Trypan Purple™ y Trypan Red Plus™ son alternativas menos tóxicas al azul tripán y de utilidad análoga. Trypan UltraBlue™, Trypan Purple™ y Trypan Red Plus™ están altamente purificados y se pueden usar hasta 0,5 mM, 0,75 mM o 1 mM, respectivamente, con una citotoxicidad celular mínima.

Las células marcadas con tinciones vitales de tripano deben cargarse en un hemocitómetro y examinarse inmediatamente bajo un microscopio óptico a bajo aumento. Los tiempos de incubación más prolongados darán lugar a una mayor muerte celular y recuentos de viabilidad reducidos. Para calcular el porcentaje de células viables, divida el número total de células viables por el número total de células y multiplique por 100.

Tabla 1. Especificaciones para tinción vital azul tripán y derivados.

Producto	Peso Mol.	Abs (nm)	Presentación	Cat No.
Trypan UtraBlue™, sodium salt 0.1 M aqueous solution	∼600	618	1 mL	2455
Trypan Red Plus™, 0.1 M aqueous solution	∼600	534	10 mL	2456
Trypan Red Plus™, 0.1 M aqueous solution	∼600	534	100 mL	2457
Trypan Purple™, 0.1 M aqueous solution	∼600	586	10 mL	2465
Trypan Purple™, 0.1 M aqueous solution	∼1000	586	100 mL	2466
Trypan Blue, sodium salt UltraPure grade, Purified to eliminate fluorescent impurities	∼960	607	10 g	2452
Trypan Blue, sodium salt CAS 72-57-1	∼960	607	100 g	2450
Trypan Blue, sodium salt 10 mM aqueous solution	∼960	607	10 mL	2453

Colorantes de viabilidad de ácido nucleico

Los colorantes de viabilidad de ácidos nucleicos, como el yoduro de propidio (PI), 7-AAD y las tinciones de células muertas Nuclear DCS1™, son colorantes de unión a ácidos nucleicos impermeables a la membrana para detectar poblaciones de células muertas mediante citometría de flujo, microscopía de fluorescencia y microplacas basadas en fluorescencia. ensayos Si bien están excluidos de las células viables, estos tintes penetran fácilmente en las membranas comprometidas de las células muertas y se unen selectivamente al ADN, por lo que la fluorescencia y el rendimiento cuántico aumentan drásticamente. Más importante aún, debido a que los colorantes de unión a ácidos nucleicos son esencialmente no fluorescentes en ausencia de ADN, no se requieren pasos de lavado y la interferencia de fondo es mínima. Los colorantes de unión a ácido nucleico se utilizan con frecuencia con sustratos de esterasa intracelular permeables a las células, sondas sensibles al potencial de membrana (sondas de potencial de membrana mitocondrial) e indicadores de iones fluorescentes (indicadores de calcio) para detectar simultáneamente poblaciones de células vivas y muertas.

Los colorantes Propidium Iodide, 7-Aminoactinomycin D y Cyanine para medir celulas muertas.

PI and 7-AAD

Los colorantes propidium iodide (PI) and 7-aminoactinomycin D (7-AAD) sin impermeables a las celulas y colorantes intercalados de fluorescencia roja que se utilizan a menudo para detectar poblaciones de células muertas mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. El PI se une al ADN y al ARN al intercalarse entre las bases con poca o ninguna preferencia de secuencia, mientras que el 7-AAD se intercala en el ADN de doble cadena con una gran afinidad por las regiones ricas en GC. No obstante, ambos experimentan aumentos de fluorescencia significativos al unirse al ADN, con un aumento de PI de 20 a 30 veces. El PI puede ser excitado por una lámpara de arco de xenón, una lámpara de arco de mercurio o por las líneas espectrales de 488 nm o 514 nm del láser de iones de argón. De manera similar, el láser de iones de argón puede excitar bien el 7-AAD. Sin embargo, la excitación óptima se logra cuando se utiliza la línea espectral de 543 nm del láser de helio-neón. Estas tinciones exhiben cambios significativos de Stokes con PI emitiendo al máximo a 618 nm y 7-AAD a 648 nm, lo que las hace útiles para el análisis multicolor con sondas fluorescentes azules y verdes.

Ninguno de los colorantes se puede fijar con glutaraldehído o paraformaldehído (PFA). Sin embargo, pueden usarse en células fijadas y permeabilizadas para el análisis del ciclo celular mediante la medición del contenido de ADN (es decir, PI requerirá la adición de RNase). Alternativamente, la alta afinidad de 7-AAD por las regiones de ADN ricas en GC lo hace útil para estudios de bandas cromosómicas. La unión de 7-AAD al ADN produce un patrón distinto en los cromosomas politénicos y la cromatina.

Colorantes diméricos de cianina

La serie de colorantes diméricos de cianina de DiTO™ y DiYO™ también muestra una sensibilidad excepcional para varias especies de ácidos nucleicos, incluido el ADN de doble cadena (dsDNA), el ADN de cadena sencilla (ssDNA) y el ARN. Exhiben un aumento de la fluorescencia de 100 a 1000 veces tras la unión del ácido nucleico, y sus coeficientes de extinción molares son de un orden de magnitud mayor que los homodímeros de etidio. Los colorantes DiYO™-1 y DiTO™-1 se excitan de forma óptima con la línea espectral de 488 nm y 514 nm del láser de iones de argón, respectivamente, y emiten fluorescencia verde. Los tintes DiYO™-3 y DiTO™-3 se excitan bien con el láser He-Ne y emiten fluorescencia roja. Todos los tintes de las series DiYO™ y DiTO™ se suministran como soluciones de 5 mM en DMSO, excepto DiYO™-1, que también está disponible como sólido. Los tintes de monómero de cianina TWO-PRO™ 1 y TWO-PRO™ 3 también se pueden usar para analizar el contenido de ADN en células muertas.

Discriminación de dos colores de poblaciones vivas y muertas de Bacillus subtilis mediante el kit de imágenes de bacterias vivas/muertas fluorescentes MycoLight™ (n.º de cat. 22411). Las bacterias vivas con esterasa intracelular activa se marcaron con MycoLight™ 520 (verde), mientras que el 70 % de bacterias muertas eliminadas por alcohol con membranas comprometidas se marcaron con yoduro de propidio (rojo).

Tabla 2. Especificaciones para tintes de dímero de cianina PI, 7-AAD y cyanine

Producto	Ex (nm)	Em (nm)	ε (cm-1M-1)	Φ	Espectro	Presentación	Cat No.
7-AAD [7-Aminoactinomycin D]	549	648	27,500	0.02		1 mg	17501
TWO-PRO™ 3 [equivalent to TO-PRO®-3] 5 mM DMSO solution	642	657	102,000	0.11		0.2 mL	17572
TWO-PRO™ 1 [equivalent to TO-PRO®-1] 5 mM DMSO solution	515	531	62,800	0.25		0.2 mL	17571
Propidium Iodide 10 mM aqueous solution	537	618	6,000	0.2		1 mL	17517
Propidium Iodide	537	618	6,000	0.2		25 mg	17515
Propidium Iodide	537	618	6,000	0.2		5g	17516
DiYO™-3 [equivalent to YOYO®-3] 5 mM DMSO solution	612	631	167,000	0.15		0.2 mL	17581
DiYO™-1 [equivalent to YOYO®-1] 5 mM DMSO solution	491	508	98,900	0.52		0.2 mL	17580
DiYO™-1 [equivalent to YOYO®-1]	491	508	98,900	0.52		1 mg	17579
DiTO™-3 [equivalent to TOTO®-3] 5 mM DMSO solution	642	661	154,000	0.06		0.2 mL	17576
DiTO™-1 [equivalent to TOTO®-1] 5 mM DMSO solution	514	531	117,000	0.34		0.2 mL	17575

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NUCLEAR DCS1™ Tintes de células muertas

Las tinciones de células muertas DCS1™ de Nuclear son una familia de colorantes de ácido nucleico de alta afinidad impermeables a la membrana para analizar el contenido de ADN en células muertas, fijadas o permeabilizadas. Estos tintes penetran fácilmente en las membranas comprometidas de las células muertas y se unen selectivamente al ADN, produciendo señales excepcionalmente brillantes. En medios acuosos, los colorantes Nuclear DCS1™ son esencialmente no fluorescentes y se pueden agregar convenientemente a las células sin un paso de lavado adicional y generar imágenes con una interferencia mínima. Los espectros de emisión y absorción de fluorescencia de los colorantes Nuclear DCS1™ abarcan el espectro de luz visible desde el violeta hasta el rojo, lo que los hace compatibles con varias plataformas de fluorescencia, incluidos microscopios de fluorescencia, citómetros de flujo y lectores de microplacas. Además, los múltiples formatos de un solo color de estos tintes brindan la flexibilidad necesaria para facilitar las aplicaciones multicolores en imágenes y citometría de flujo. Todos los colorantes de la serie Nuclear DCS1™ se suministran como soluciones de 5 mM en DMSO.

Células HeLa fijadas con formaldehído teñidas con Nuclear Red™ DCS1 (Cat No. 17552) y Phalloidin-iFluor^® 488 conjugate (Cat No. 23115).

Tabla 3. Especificaciones para tinciones de células muertas Nuclear DCS1™

Producto	Ex (nm)	Em (nm)	Espectro	Presentación	Cat No.
Nuclear Violet™ DCS1	371	454		0.5 mL	17549
Nuclear Red™ DCS1	631	651		0.5 mL	17552
Nuclear Orange™ DCS1	514	556		0.5 mL	17551
Nuclear Green™ DCS1	503	527		0.5 mL	17550
Nuclear Blue™ DCS1	348	469		0.5 mL	17548

Tintes de viabilidad fijables Amine-Reactive Cell Meter™

Los colorantes de viabilidad fijables Cell Meter™ son colorantes reactivos con aminas, impermeables a la membrana, diseñados para discriminar poblaciones de células vivas y muertas en citometría de flujo. Estos tintes penetran fácilmente en las células muertas con la integridad de la membrana comprometida y se unen de forma irreversible a las proteínas de amina celular y otros componentes intracelulares que producen una fluorescencia celular significativa. En las células vivas, estos tintes no pueden penetrar la membrana, dejando solo las aminas de la superficie celular para unirse y emitir una débil fluorescencia. La diferencia de intensidad entre las células viables y las muertas es significativa, lo que facilita la exclusión de las células muertas del análisis. Debido a que la tinción es robusta y estable, las células marcadas con colorantes de viabilidad fijables Cell Meter™ pueden fijarse, permeabilizarse y someterse a prueba para inmunofenotipado intracelular. Los tintes de viabilidad fijables Cell Meter™ están disponibles en 9 tintes fluorescentes para proporcionar a los usuarios una mayor flexibilidad en el diseño de paneles multicolores. Los tintes incluidos en esta serie son excitados por fuentes de excitación primarias, incluidas las líneas láser de 405, 488, 633 y 647 nm, y emiten en canales comunes.

Detección de la viabilidad de las células Jurkat mediante el colorante de viabilidad fijable Cell Meter™ BX590. Las células Jurkat se trataron y tiñeron con Cell Meter™ BX590 (Cat No. 22514), se fijaron en formaldehído al 3,7 % y se analizaron mediante citometría de flujo. La población de células muertas (pico azul) se distingue fácilmente de la población de células vivas (pico rojo) con el canal PE-Texas Red. Se obtuvieron resultados casi idénticos antes y después de la fijación.

Tabla 4. Colorantes de viabilidad fijables para el análisis de células vivas/muertas durante la citometría de flujo

Producto	Ex (nm)	Em (nm)	Espectro	Presentación	Cat No.
ReadiView™ Green/Red Viability Stain				100 Tests	22762
Cell Meter™ VX500 fixable viability dye	433	498		200 Tests	22542
Cell Meter™ VX450 fixable viability dye	406	445		200 Tests	22540
Cell Meter™ RX780 fixable viability dye	629	767		200 Tests	22536
Cell Meter™ RX700 fixable viability dye	690	713		200 Tests	22532
Cell Meter™ RX660 fixable viability dye	649	664		200 Tests	22530
Cell Meter™ IX830 fixable viability dye	811	822		200 Tests	22529
Cell Meter™ BX650 fixable viability dye	518	654		200 Tests	22520
Cell Meter™ BX590 fixable viability dye	492	579		200 Tests	22514
Cell Meter™ BX520 fixable viability dye	491	516		200 Tests	22510

Medición de la actividad enzimática en células vivas

Las células vivas contienen varias esterasas citosólicas no específicas responsables de catalizar la hidrólisis de ésteres, una reacción crítica en el metabolismo celular y de fármacos. La actividad de estas enzimas se puede detectar con una amplia variedad de sustratos de esterasa fluorogénica, que incluyen calceína AM, BCECF AM y diacetato de carboxifluoresceína (CFDA), y se puede usar para identificar poblaciones de células vivas. Como compuestos casi neutros, los sustratos de esterasa se difunden libremente y de forma no invasiva a través de la membrana plasmática y penetran en el citosol de las células vivas. Una vez dentro de la célula, las esterasas citosólicas hidrolizan rápidamente estos sustratos no fluorescentes en productos polares altamente fluorescentes retenidos por las células con la integridad de la membrana intacta. Las células marcadas se pueden medir mediante microscopía de fluorescencia, citometría de flujo o un lector de microplacas de fluorescencia. Se pueden combinar con indicadores apoptóticos y necróticos para el análisis de salud celular multiparamétrico.

Tintes de calceína AM para marcar células vivas

La calceína AM (es decir, un colorante de calceína sintetizado con ésteres de acetoximetilo (AM)) es un sustrato de esterasa fluorogénico permeable a las células que se utiliza para identificar células vivas. La modificación de la calceína y otros compuestos polares con grupos AM promueve la permeabilidad celular al aumentar su hidrofobicidad y, lo que es más importante, hace que la hidrolización de esterasas sea un requisito para activar su fluorescencia. Después de una breve incubación e hidrólisis de calceína-AM, las células viables emitirán una fluorescencia verde brillante cuando se exciten con la línea espectral de 488 nm del láser de iones de argón o con cualquier otra fuente de excitación de luz azul. En comparación con otros sustratos de esterasa, como BCECF AM o CFDA, la fluorescencia más brillante, la fotoestabilidad y la baja citotoxicidad de la calceína-AM son ventajosas para varios estudios, incluido el seguimiento celular, la adhesión celular, la quimiotaxis, la resistencia a múltiples fármacos, la viabilidad celular, la apoptosis y citotoxicidad.

En consecuencia, el máximo de emisión de fluorescencia de la calceína a ~ 521 nm dificulta su uso en combinación con células transfectadas con GFP u otros indicadores fluorescentes verdes para análisis multiplex. Para abordar la limitación de un solo color de la calceína-AM, AAT Bioquest ha desarrollado derivados de calceína en una amplia gama de opciones de color, que incluyen Calcein Blue AM, Calcein Orange™ AM y Calcein Red™ AM, y Calcein Deep Red™ AM para tintes multicolor. marcaje y análisis funcional de células vivas. Por ejemplo, la calceína Blue AM es un indicador de viabilidad excitable por luz ultravioleta que emite una fluorescencia máxima a ~441 nm y está diseñado para usarse con instrumentos optimizados para detectar la fluorescencia azul. Se puede combinar con la tinción de fosfatidilserina Anexina V iFluor® 488 (n.º de cat. 20071) y la tinción de células muertas de ácido nucleico 7-AAD para la discriminación de tres colores de poblaciones de células vivas/apoptóticas/necróticas.

Tintes de viabilidad CytoCalcein™ Violet optimizados para Citometría de Flujo

CytoCalcein™ Violet 450 y CytoCalcein™ Violet 500 están optimizados para su uso en citometría de flujo. La conversión enzimática de CytoCalcein™ Violet 450 AM y CytoCalcein™ Violet 500 AM no fluorescentes en productos altamente fluorescentes CytoCalcein™ Violet 450 y CytoCalcein™ Violet 500 (Ex/Em máximo ~406/445 nm y ~420/505 nm, respectivamente) se excitan eficientemente con el láser violeta estándar de 405 nm que se encuentra en la mayoría de los citómetros de flujo. Junto con las tinciones de células muertas de ácido nucleico fluorescente rojo con yoduro de propidio (PI, Ex/Em máximo ~537/618 nm) o 7-Aminoactinomicina D (7-AAD, Ex/Em ~549/648 nm), los colorantes CytoCalcein™ Violet son excelentes fluoróforos para la discriminación de dos colores entre poblaciones de células vivas y muertas en función de la integridad de la membrana y la actividad de la esterasa. La eliminación de puntos de datos que representan células muertas es un paso fundamental para mejorar la precisión de su análisis de citometría de flujo. A menudo, las células muertas se unirán de forma no específica a muchos reactivos, lo que contribuirá a resultados falsos positivos.

Detección de viabilidad de células Jurkat utilizando calceína Blue AM. Las células Jurkat se trataron con estaurosporina y se tiñeron con Calcein Blue AM (Cat No. 22007, blue), annexin V iFluor^® 488 (Cat No. 20071, green) y 7-AAD (Cat No. 17501, red).

Tabla 5. Especificaciones para calcein AM y derivados de calcein AM

Producto	Ex (nm)	Em (nm)	Espectro	Presentación	Cat No.
CytoCalcein™ Violet 500 Excited at 405 nm	420 nm	505 nm		1 mg	22013
CytoCalcein™ Violet 450 Excited at 405 nm	406 nm	445 nm		1 mg	22012
Calcein UltraBlue™	359 nm	458 nm		1 mg	21908
Calcein Red™ AM	562 nm	576 nm		1 mg	21900
Calcein Orange™ diacetate	531 nm	545 nm		1 mg	22009
Calcein Deep Red™ AM ester	643 nm	663 nm		1 mg	22011
Calcein Blue, AM CAS 168482-84-6	354 nm	441 nm		1 mg	22007
Calcein, AM UltraPure grade CAS 148504-34-1	501 nm	521 nm		1 mg	22003
Calcein, AM UltraPure grade CAS 148504-34-1	501 nm	521 nm		20x50 µg	22004
Calcein, AM CAS 148504-34-1	501 nm	521 nm		1 mg	22002

Medición de la actividad metabólica en células vivas

Los indicadores metabólicos, como las sales de tetrazolio y la resazurina, miden el potencial de reducción celular en células metabólicamente activas para evaluar la viabilidad, la citotoxicidad y la proliferación. Después de la reducción, estos sustratos producen productos colorimétricos brillantes que se pueden medir con un espectrofotómetro o un lector de microplacas en configuraciones de bajo o alto rendimiento. La resazurina reducida también puede emitir fluorescencia y medirse con un lector de microplacas de fluorescencia.

Sales de tetrazolio para la viabilidad celular

Las cuatro sales de tetrazolio utilizadas para medir la viabilidad son MTT, MTS, XTT y WST-8. De los cuatro, el MTT tiene carga positiva y puede penetrar fácilmente en las células viables. Los otros (MTS, XTT y WST-8) tienen carga negativa y son impermeables a la membrana y requieren un aceptor de electrones intermedio que pueda transferir electrones desde el citoplasma o la membrana plasmática para facilitar la reducción en productos de formazán coloreados. La reducción de MTT es la más común. Sin embargo, para la mayoría de los ensayos de MTT comerciales, se requiere la solubilización del producto de formazán púrpura en DMSO o isopropanol antes de la cuantificación. El práctico kit de proliferación de células MTT colorimétricas Cell Meter™ (n.º de cat. 22768) simplifica la tarea de contar células en un formato fácil de mezclar y leer sin necesidad de solubilización. La concentración de formazán determinada por la densidad óptica a 560 nm es directamente proporcional al número de células vivas.

Entre las otras sales de tetrazolio, la WST-8 soluble en agua ofrece la mayor sensibilidad. La reducción de WST-8 por deshidrogenasas celulares produce cristales de formazán naranja solubles en agua que no requieren solubilización antes de la cuantificación. La concentración del producto de formazán se puede determinar midiendo la absorbancia a 460 nm y es proporcional al número de células vivas. El kit de cuantificación de células WST-8 Colorimetric de Cell Meter™ proporciona un ensayo sensible con una linealidad excepcional de hasta ~106 células por pocillo. No se requiere mezclar previamente los componentes, ya que el sustrato WST-8 se proporciona convenientemente en una solución que se puede agregar directamente a las células. Cada kit proporciona reactivos suficientes para ~1000 (22770) o ~5000 pruebas (22771) utilizando una microplaca estándar de 96 pocillos. WST-8 también está disponible como reactivo independiente en tamaños de unidad de 25 mg (Cat No. 15705), 100 mg (Cat No. 15706) y 1 g (Cat No. 15707) suministrados como soluciones acuosas de 50 mM.

La proliferación celular se determinó utilizando el kit de proliferación celular MTT colorimétrico Cell Meter™. Se añadieron células HeLa de 0 a 40.000 células/pocillo/100 µl a una placa de 96 pocillos de fondo transparente durante la noche. La absorbancia se midió a 560 nm usando un lector SpectraMax (Molecular Devices). Se detectaron 500 células/pocillo en comparación con ~5000 células/pocillo con el kit de ensayo MTT de Sigma.

Tabla 6. Ensayos colorimétricos Colorimetric MTT y WST-8 basados en sal para medir la proliferación celular

Producto	Presentación	Cat No.
ReadiUse™ WST-8 50 mM aqueous solution	1 g	15707
ReadiUse™ WST-8 50 mM aqueous solution	100 mg	15706
ReadiUse™ WST-8 50 mM aqueous solution	25 mg	15705
ReadiUse™ MTS Reagent 50 mM aqueous solution	5 mL	15710
Cell Meter™ Colorimetric WST-8 Cell Quantification Kit	5000 Tests	22771
Cell Meter™ Colorimetric WST-8 Cell Quantification Kit	1000 Tests	22770
Cell Meter™ Colorimetric MTT Cell Proliferation Kit	5000 Tests	22769
Cell Meter™ Colorimetric MTT Cell Proliferation Kit	1000 Tests	22768

Resazurin

La resazurina, también conocida como Alamar Blue, es un indicador sensible a redox soluble en agua que se puede usar para medir la viabilidad celular de células de mamíferos, bacterias y hongos. En células vivas metabólicamente activas, la resazurina de color azul y no fluorescente se reduce irreversiblemente a una resorufina de color rosa y altamente fluorescente mediante la respiración aeróbica. La salida de la señal se puede medir con un espectrofotómetro estándar a 570 nm o mediante fluorimetría con un conjunto de filtros de 544/590 nm y es proporcional al número de células viables en un amplio rango de concentración. Dado que la resazurina es mínimamente tóxica para las células vivas, es útil para medir cuantitativamente la proliferación celular y otros estudios a largo plazo.

Tabla 7. Epecificaciones para Resazurin

Producto	Abs (nm)	Ex/Em (nm)	Presentación	Cat No.
Resazurin, sodium salt CAS 62758-13-8	605	571/584	100 mg	15700