Nuestro kit de ensayo de relación NADP/NADPH Amplite® proporciona un método conveniente para la detección sensible de NADP, NADPH y su relación. Además, tiene un fondo muy bajo ya que se ejecuta en el rango rojo visible que reduce significativamente la interferencia de las muestras biológicas.
Descripción
El dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) y el fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP+) son dos cofactores importantes que se encuentran en las células. NADH es la forma reducida de NAD+, y NAD+ es la forma oxidada de NADH. Forma NADP con la adición de un grupo fosfato a la posición 2′ del nucleótido de adenilo a través de un enlace éster. El NADP se utiliza en reacciones biológicas anabólicas, como la síntesis de ácidos grasos y ácidos nucleicos, que requieren NADPH como agente reductor.
Los ensayos tradicionales de NAD/NADH y NADP/NADPH se realizan monitoreando la absorción de NADH o NADPH a 340 nm. Este método es de baja sensibilidad y alta interferencia ya que el ensayo se realiza en el rango UV que requiere una microplaca de cuarzo costosa.
Nuestro kit de ensayo de relación NADP/NADPH Amplite® proporciona un método conveniente para la detección sensible de NADP, NADPH y su relación. Las enzimas del sistema reconocen específicamente NAD/NADH en una reacción de ciclo enzimático. No es necesario purificar NADP/NADPH de la mezcla de muestra. La reacción del ciclo enzimático aumenta significativamente la sensibilidad de detección.
Además, este ensayo tiene un fondo muy bajo ya que se ejecuta en el rango rojo visible que reduce significativamente la interferencia de las muestras biológicas. El ensayo ha demostrado alta sensibilidad y baja interferencia. Este kit de ensayo de NADP/NADPH fluorimétrico Amplite® se puede realizar en un conveniente formato de placa de microtitulación de 96 pocillos o de 384 pocillos y se puede adaptar fácilmente a la automatización sin necesidad de pasos de separación.
| Catalogo | Producto | Presentación |
|---|---|---|
| AAT-15264 | Amplite® Fluorimetric NADP/NADPH Ratio Assay Kit *Red Fluorescence* | 250 pruebas |
Importante: Solo para uso en investigación (RUO).
Plataforma
Lector de Microplacas de Absorbancia
| Absorbancia | 576 ± 5 nm |
| Placa recomendada | Fondo transparente |
Lector de Microplacas de Fluorescencia
| Excitación | 540 nm |
| Emisión | 590 nm |
| Cutoff | 570 nm |
| Placa recomendada | Negra sólida |
Componentes
| Componente A: NADP/NADPH Recycling Enzyme Mix | 2 botellas (polvo liofilizado) |
| Componente B: NADPH Sensor buffer | 1 botella (20 mL) |
| Componente C: NADPH Estandar | 1 vial (167 µg) |
| Componente D: Solución de extracción NADPH | 1 botella (10ml) |
| Componente E: Solución de extracción NADP | 1 botella (10ml) |
| Componente F: Solución de Control NADP/NADPH | 1 botella (10ml) |
| Componente G: NADP/NADPH Lysis Buffer | 1 botella (10ml) |
PREPARACION DE SOLUCION DE STOCK
A menos que se indique lo contrario, todas las soluciones madre no utilizadas deben dividirse en alícuotas de un solo uso y almacenarse a -20 °C después de la preparación. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación.
Solución estándar de NADPH (1 mM)
Agregue 200 µl de buffer PBS en el vial de estándar de NADPH (componente C) para preparar una solución estándar de NADPH de 1 mM (1 nmol/µl).
PREPARACION DE SOLUCION DE ESTANDAR
Para su conveniencia puede usar el Planificador de dilución en serie: https://www.aatbio.com/tools/serial-dilution/15264
Estándar NADPH
Agregue 10 μl de solución estándar de NADPH de 1 mM a 990 μl de buffer PBS (pH 7,4) para generar una solución estándar de NADPH de 10 μm (10 pmols/μl) (NS7). Tome una solución estándar de NADPH de 10 µM y realice diluciones en serie 1:3 en PBS para obtener diluciones en serie del estándar de NADPH (NS6 – NS1). Nota: la solución estándar de NADPH diluida es inestable y debe usarse dentro de las primeras 4 horas.
PREPARACION DE SOLUCION DE TRABAJO
Agregue 10 ml de buffer de sensor de NADPH (componente B) en la botella de mezcla de enzimas de reciclaje de NADP/NADPH (componente A) y mezcle bien para obtener una solución de trabajo de NADP/NADPH.
Nota: Esta solución de trabajo de NADP/NADPH es suficiente para 125 ensayos en una placa de 96 pocillos.
Imagen
Figura 1. La respuesta a la dosis de NADPH se midió con el kit de ensayo de relación NADP/NADPH fluorimétrico Amplite® en una placa negra sólida de 96 pocillos utilizando un lector de microplacas Gemini (Molecular Devices).
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